【读书笔记】噬菌体展示技术--通用实验指南

黄帮主

噬菌体展示技术是一种将外源多肽或蛋白质与特定噬菌体衣壳蛋白相融合，展示于噬菌体表面来构建蛋白质或多肽文库，并从中筛选目的蛋白，多肽或抗体的基因工程高新技术。
在肿瘤学，免疫学，蛋白质工程和配体，受体的研究领域中，该技术逐渐发展成为主流技术。目前噬菌体展示技术的研究进展非常迅速，在抗原决定簇的定位、蛋白质相互作用位点的确定、特异调节分子的分离和人工抗体和疫苗的制备、诊断技术、酶抑制剂的研究开发、多肽药物的研制等生物技术研究的不同领域得到了应用，并对这些领域产生了深远的影响。
该技术的最大特点是将基因型和表型直接耦联，确保能够方便，快速获得所展示的目的蛋白和编码此蛋白的基因。

噬菌粒/辅助噬菌体系统是一种常见的噬菌体展示系统，其中噬菌粒是人工构建的一类质粒。包含有单链噬菌体包装序列，复制起点，质粒复制子，克隆位点，抗生素筛选基因，方便克隆。
辅助噬菌体对噬粒的复制和组装发挥着至关重要的作用。

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丝状噬菌体：
在用作克隆载体尤其是用于展示载体的很多方面都非常理想。
丝状噬菌体的基因组比较小，能感染革兰阴性菌。
含有一个环状的单链DNA基因组。
基因组很小，只有12个或者更少的紧密排列的基因，和一个包含DNA复制和包装所需序列的基因间隔区。
丝状噬菌体在感染菌中，生产和释放购不会破坏细胞或者使细胞裂解。

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M13K07 辅助噬菌体
由M13衍生而来。具有卡那霉素抗性。
能在无噬菌质粒的情况下复制。
当有噬菌质粒时，由于噬菌质粒含有野生型M13或者f1复制起始点，单链噬菌质粒的DNA会被优先包装并分泌。


M13K07为单链辅助噬菌体，长8669
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野生型M13噬菌体：
M13，fd和fl三种丝状噬菌体基因组，颗粒大小形状接近，DNA序列全长已经清楚。如M13，长6407，闭环ssDNA，通过吸附细胞壁上性纤毛的方式感染雄性大肠杆菌。
进入细胞后，噬菌体单链DNA转变为双链DNA，并不杀死细胞，抑制细胞生长。平皿上生长会形成浑浊的噬菌斑。
双链DNA会复制生成大量的单链DNA，包装成成熟的子代噬菌体释放出来，每毫升培养液可以提取5-10ug的ssDNA。
双链DNA存在于细胞
单链DNA分泌到大肠杆菌以外。
故野生型M13具有改造基因克隆载体的潜能。

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改造的M13噬菌体：
1977年后，以Messing为代表的研究小组对M13进行系列改造，构建得到日趋成熟的M13载体。
在丝状噬菌体基因组上，基因II和IV之间，有一段50bp的间隔区，也被称为间隔顺序IS。
它不编码蛋白质，但是和DNA的复制转录和噬菌体的包装具有密切的联系。
IS区域插入外源DNA会干扰噬菌体的复制，
IS之外的区域均为病毒复制所必须。
对野生型M13的改造主要集中在IS区域。
① 在IS区域插入筛选标记:
加入大肠杆菌lac操纵子和编码β-半乳糖苷酶的前一部分即LacZ（146aa)，可以进行蓝白筛选。这个改造的载体称为M13mp1
② 引入适当的唯一酶切位点EcoR I：这个改造的载体称为M13mp2
③ 加入MCS，引入更多的酶切位点。这些改造的载体称为M13mp7---19

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利用TG1和XL1-blue作为宿主菌用于Fab噬菌体展示时，TG1展示的噬菌体中带有外源蛋白的噬菌体的比例远高于XL1-blue

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通常用于噬菌体展示的载体有两类：即噬菌体载体和噬菌粒载体
噬菌粒载体基因组较小，易于操作，可插入的片段较大，转化效率高，产生的重组体更加稳定等优点，噬菌粒只含噬菌体的部分遗传信息，包装完整的噬菌体需要辅助噬菌体为其提供复制和包装所需的蛋白酶和外壳蛋白。

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噬菌粒是一个集质粒和丝状噬菌体特征于一身的载体，具有ColE1复制起点、抗生素抗性选择标记、以及丝状噬菌体的间隔区（IG区）。虽然噬菌粒载体携带有M13噬菌体的IG区，但是因其缺乏M13噬菌体的功能基因，不能独立合成单链DNA。在细菌中，没有辅助噬菌体的超感染，噬菌粒只能像质粒一样进行基因扩增；而有了辅助噬菌体的超感染，由辅助噬菌体提供的pII蛋白启动噬菌粒的滚环复制，噬菌粒IG区的复制起始位点产生ssDNA，随后ssDNA与pⅠ、pⅣ、pⅪ和宿主细胞的硫氧还原蛋白共同作用，组装形成含有噬菌粒基因组的噬菌体，成熟的噬菌体由细胞质释放到外部环境中。

辅助噬菌体是一种自身DNA复制效率极低的丝状噬菌体突变型。其基因组具有M13 噬菌体的所有功能基因，但IG区是缺陷的，不能被pII蛋白识别，因而辅助噬菌体本身DNA也不能进行单链复制和基因表达。为使辅助噬菌体的所有功能基因都能表达，必须在辅助噬菌体的基因组中导入新的复制起点。辅助噬菌体能为噬菌粒提供pⅡ蛋白和包装蛋白，在辅助噬菌体的帮助下，噬菌粒可以顺利地进行DNA复制与噬菌体的包装，完成对宿主的侵染，这一过程通常称为超染，常用的辅助噬菌体有VCSM13 和M13K07（带有kana抗性）等。
辅助噬菌体的工作原理为：当含有重组基因的噬菌粒转染至大肠杆菌后，再用辅助噬菌体进行超染，辅助噬菌体合成的pⅡ蛋白就会优先识别噬菌粒上的正常基因间隔区（IG region）,启动滚环复制，产生ssDNA，这样所产生的子代噬菌体外壳蛋白所包装的ssDNA 主要是来自含有重组基因组的噬菌粒的DNA，并同时展示噬菌粒编码的pⅢ或pⅧ与外源肽段的融合蛋白和辅助噬菌体编码的野生型pⅢ或pⅧ蛋白，确保重组噬菌体能正常感染、组装和增殖。

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噬菌体颗粒的结构：
大多数丝状噬菌体的信息来源于感染大肠杆菌的噬菌体，f1/M13/fd，这些噬菌体的共同特征是含有一个五重旋转轴，一个两重固定轴。
这些噬菌体统称为Ff噬菌体。
直径约6.5nm
长度根据基因组的大小决定。
噬菌体颗粒由5个衣壳蛋白组成。
① 环绕单链DNA的中空管状结构由数千个50个氨基酸残基的主要衣壳蛋白pVIII组成。这些蛋白微倾斜，形成一个右手螺旋结构。
② 颗粒钝端有5个pVII蛋白和pIX蛋白。
③ pIII蛋白，有406个氨基酸，N端有感染能力，三个结构域已经被确定。
④ pVI蛋白在颗粒的位置尚未确定。

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噬菌体展示所使用的衣壳蛋白
5个衣壳蛋白在不同程度上都被用来展示过蛋白或多肽。
最为常用的是病毒蛋白III和VIII。
VIII蛋白在噬菌体颗粒中存在几千拷贝，通过羧基端展示6-8个残基的多肽序列。
更大的长度回阻止颗粒的包装。
PIII蛋白最为常用，可以允许大片段的插入，能以单价展示相容。