用噬菌体随机肽库筛选SARS冠状病毒S蛋白单克隆抗体2C5的模拟表位

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用噬菌体随机肽库筛选SARS冠状病毒S蛋白单克隆抗体2C5的模拟表位

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摘要：
SARS COV S蛋白特异的单克隆抗体2C5具有病毒中和作用。
以单克隆抗体2C5为筛选靶分子，筛选噬菌体展示随机7肽库。经三轮淘洗后随机挑选20个噬菌体克隆进行，结果表明TPEQQFT可能为单克隆抗体的模拟表位。该结果可对进一步研究S蛋白结构与功能和设计SARS疫苗有一定的参考意义。

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SARS冠状病毒的spike蛋白是病毒一种重要结构蛋白，它在介导病毒粒子和宿主细胞受体结合，以及诱导中和抗体中起重要作用。SARS-CoV的功能性受体是ACE2，有研究表明S蛋白中的一个193aa残基的片段（318-510）能有效结合ACE2，并且其中第454氨基酸残基在受体结合中是不能改变的。
对S蛋白结构和功能的研究方面，抗原表位的鉴定是一个重要的工作，特别是对中和性抗原表位的鉴定，有助于对SARS基因工程疫苗的设计研究。
用噬菌体随机肽库筛选抗原表位不仅可以鉴定线性抗原表位，还可以得到其他方法难以鉴定的蛋白抗原构象表位的模拟表位。

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实验所用材料：
pGEX-6P-1，原核表达载体
真核表达SARS S蛋白的质粒
S蛋白单抗2C5，具有病毒中和活性。
噬菌体随机7肽库。

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噬菌体肽库的筛选：
包被抗原：单克隆抗体2C2，在三轮淘洗中包被浓度逐渐降低。
洗涤液体：三次淘洗过程中，洗涤液中的Tween-20浓度逐渐提高。
经过三轮“吸附--洗脱--扩增”进行富集筛选，测定噬菌体的投入产出，计算投入产出比，逐轮升高。

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挑取20个噬菌斑进行扩增纯化，进行·噬菌体ELISA，OD值大于0.25的克隆有八个。测序结果显示这八个克隆中有7个的7肽序列是一致的，即为TPEQQFT。

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将TPEQQFT序列和S蛋白全长序列进行比对分析，结果发现7肽序列TPEQQFT分散在S蛋白第539-559氨基酸序列间。

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分析展示有TPEQQFT7肽序列的噬菌体克隆对单抗2C5与S蛋白抗原结合的抑制效果，结果显示，当噬菌体数量为10^11pfu/孔时几乎能完全抑制2C5与S蛋白的结合。

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噬菌体展示能将多肽以融合蛋白形式展示在噬菌体表面，保持相对独立的空间结构和生物活性，并且用免疫学亲和纯化方法筛选，是一种筛选靶标蛋白和多肽的强有力方法。
可以广泛应用于蛋白质相互作用的研究中，新型疫苗的研制，药物开发，诊断试剂制备，抗原表位的鉴定，特异性调节分子的分离，细胞表面工程的研究中。

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后续：
进一步融合表达S蛋白的539-559多肽，结果显示该多肽的确是S蛋白的一个线性表位，但是与单抗2C5的回归免疫学反应表明它并不是2C5的表位。
展示该序列的噬菌体克隆对单抗2C5与S蛋白抗原间的ELISA反应的确有竞争抑制作用，表明此序列为单抗2C5的一个模拟表位。