Identification of a critical neutralization determinant of severe acute respi...

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Identification of a critical neutralization determinant of severe acute respiratory syndrome (SARS)-associated coronavirus: Importance for designing SARS vaccines

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摘要笔记：
SARS-CoV的S蛋白是病毒识别和结合受体从而进入细胞的主要蛋白，此外也是重要的诱导产生保护性免疫的主要抗原决定簇。
本文证实S蛋白RBD区是SARS患者，免疫兔体内产生有效抗SARS中和抗体的重要抗原位点。
通过RBD抗原进行免疫吸附得到的RBD特异性抗体具有很好的中和SARS活性。
杂交瘤技术得到的两株单抗1A5/2C5中和活性很强，两株抗体分别识别RBD区不同的抗原空间表位。
并且2C5还能对阻断RBD结合细胞受体ACE2。

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SARS基因组为正链RNA，含有一个和病毒复制有关的大的读码框，四个结构蛋白的ORF（S，E，M，N），8个未知功能蛋白的ORF
基因组5′端约三分之二的区域是编码病毒RNA聚合酶复合蛋白，后三分之一的区域为编码病毒结构蛋白,按基因组上的排列顺序依次为刺突蛋白(S)、表面蛋白(E)、膜蛋白(M)和核蛋白(N)。 S蛋白插在病毒的胞膜上，构成了病毒表面的主要暴露蛋白，形成突起。

无有效药物治疗但是治愈率很高，并且感染后很低的复发率说明体内保护性免疫的有效性。
SARS患者恢复期时血清中含有较高滴度的中和抗体。
和其他冠状病毒一样，SARS病毒的S蛋白是主要的抗原决定簇，能诱导产生中和抗体和保护性免疫。
表达S蛋白的DNA疫苗可以在小鼠体内诱导产生中和性和保护性免疫。
T细胞清除实验和抗体转运实验说明保护效应主要由中和抗体介导，单独注射S蛋白的中和抗体能获得有效的保护作用。
免疫接种表达S蛋白的重组病毒颗粒，如MVA，BHPIV3等能在动物体内产生有效的中和抗体，保护小鼠免受SARS病毒攻击。
以上数据均说明S蛋白是研发SARS疫苗的一个有效靶抗原。

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S蛋白为非共价键结合二聚体，是Ⅰ型膜糖蛋白，分为4个结构域：一个短的C末端构成胞质区；一个跨膜区和两个胞膜外域(分别称为S1和S2)。S1(15-680AA)和S2（681-1255AA）
在S1蛋白中的318-510位(193aa）被定义为RBD区。RBD介导病毒和ACE2受体结合。
S蛋白具有多方面的功能,负责结合敏感细胞受体、诱导病毒胞膜和细胞膜以及细胞之间的融合、刺激机体产生中和抗体和介导细胞免疫应答。

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表达S重组蛋白：
3个真核表达载体，转染293T细胞，表达三种蛋白RBD-Fc, RBD-C9, S1-C9
SARS-CoV (Tor2 strain)的RBD区（318-510aa），链接到人IgG1标签上 (RBD-Fc) 或者是C9标签(RBD-C9)
S1区（12–672aa）和C9标签融合 (S1-C9)
转染后72小时，通过anti-C9 MAb 1D4以及Protein A Sepharose 4 Fast对不同标签的蛋白进行纯化。

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收集SARS患者血清
血清来源于40个恢复期的SARS患者（2003年，北京）。
患者诊断标准遵循WHO发布标准。
血清在56℃灭活，IFA检测和SARS-COV反应阳性，ELISA检测血清抗体为阳性。
30个健康人血清作为对照。
用表达的RBD-C9作为包被抗原，ELISA检测血清中抗体阳性，说明S蛋白RBD区在病毒感染后有很高的免疫原性。挑取4个结合能力高的患者血清进一步进行RBD抗体的分离。
检测时血清稀释倍数为1：50

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灭活病毒免疫兔
BJ-01在VERO-E6细胞中增殖后，β-丙内酯进行灭活，葡聚糖凝胶 G-50进行纯化，PEG-8000浓缩，Sepharose-CL 2B 过滤。
HPLC分析灭活后病毒纯度超过95%。
免疫4只新西兰兔，首次免疫用量30ug，间隔两周同剂量加强免疫两次。
首次免疫前和最后免疫后5天采血。

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免疫亲和层析
制备RBD-Fc偶联到溴化氢激活的琼脂糖凝胶4B柱。
通过免疫层析分离出四个患者人血清或者免疫兔血清中RBD抗体。
用Amicon Ultra-15离心过滤系统进行浓缩。
用ELISA鉴定层析前血清，穿透液，洗脱液和RBD-C9/S1-C9的结合活性。

如图显示：
A图说明分离后的血清中存在RBD抗体，并且特异性很好
B图说明患者血清中除了有RBD抗体，还存在S蛋白其他区域的抗体。

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制备假病毒，建立中和活性实验一个编码SARS-CoV (Tor2株)S蛋白的质粒和一个ENV缺陷，表达荧光素酶的HIV-1基因组质粒(pNL4-3.luc.RE) 共转染293T细胞。
转染后48小时，上清中分泌有表达SARS S蛋白的假病毒，收获后用于一次性感染ACE2-转染的293T细胞，建立抗体体外中和活性的检测实验。
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四份患者血清的中和实验检测可以看到洗脱液中和病毒的能力比穿透液强，说明恢复期SARS患者血清中超过50%的中和活性来源于RBD特异性抗体。
而正常人血清中没有对SARS假病毒颗粒的中和活性。
说明S蛋白的RBD区在病毒感染后诱导产生中和抗体。

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S蛋白RBD区是免疫兔的重要抗原表位
之前文献已报道，SARS灭活病毒免疫兔后能诱导产生中和抗体。
兔血清经过免疫层析后，流穿液血清失去和RBD-fc结合能力。而洗脱液和RBD-FC结合能力很强。
ELISA检测和中和活性实验结果和患者血清比较一致。

说明RBD区是一个诱导兔产生中和抗体的重要抗原表位。