ELISA整理资料

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PPT资料由张传峰整理
发展史：
ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。
ELISA 最早于 19 世纪 70 年代由瑞典科学家 Engvail 和 Perlmann 以及荷兰科学家 VanWeerman 和 Schuurs 分别提出，此后，免疫吸附法成为液体中微量物的常见检测方法，目前ELISA已经被广泛应用于临床医学、生物制药、食品检测及农业渔业中。

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技术原理：
1. 抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。
2. 结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性。
3. 酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。
4. 受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。
5. 此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。
6. 加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。测定方法具有很高的敏感度（pg-ng/ml水平），并且重复性好。
以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的实验技术

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ELISA的方法
双抗体夹心法测抗原
双抗原夹心法测抗体
间接法测抗体
竞争法测抗体
竞争法测抗原
捕获包被法测抗体
ABS-ELISA法

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ELISA 检测方法：
1. Abs （吸收光）检测法
2. 荧光检测法
n 荧光强度（FI）
n 荧光寿命（FL）
n 荧光偏振（FP）
n 荧光共振能量转移（FRET）
3. 发光检测法
n 化学发光
n 生物发光
其中发光有分为快速发光法（闪光法）、慢速发光法（辉光法）

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ELISA操作--试剂及材料的准备
ELISA的主要试剂有
1. 固相的抗原或抗体
2. 酶标记的抗原或抗体
3. 与标记酶直接关联的酶反应底物

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固相载体
ELISA 反应中最常用的固相载体为聚苯乙烯材料，聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能。
抗体或蛋白质抗原吸附其上后保留原来的免疫活性，聚苯乙烯为塑料，可制成各种形式。
在ELISA测定过程中，它作为载体和容器，不参与化学反应。
抗原、抗体和其它生物分子通过多种机制吸附至载体表面，这包括通过疏水键、流水/离子键的被动吸附，通过引入其它活性基团如氨基和碳基的共价结合，以及通过表面改性后的亲水键结合。

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酶标板
① 高结合力酶标板(High Binding ELISA Plate):
经表面处理后蛋白结合能力大大增强，可达到400-500ng IgG/平方厘米，主要结合的蛋白分子量>10kD.使用该类板可提供敏感性,并可相对减少包被蛋白的浓度和用量,不足之处为较易产生非特异性反应.抗原或抗体包被后,以非离子去污剂无法有效地封闭未结合的部位,需使用蛋白作为封闭剂.
② 中结合力酶标板(Medium Binding ELISA Plate):
经表面硫水键被动与蛋白结合,适合作为分子量>20kD的大分子蛋白的固相载体,其蛋白结合能力为200-300ng IgG/cm2.由于该类板所具的仅与大分子结合的特性,适用于作为未纯化抗体或抗原的固相载体,可降低潜在的非特异性交叉反应.该类板可以惰性蛋白或非离子去污剂作为封闭液.
③ 氨基化酶标板(Aminated ELISA Plate):
经表面改性处理后拥有带正电荷的氨基,其疏水键由亲水键取代.该类酶标板适合作为小分子蛋白的固相载体.使用合适的缓冲液和pH值,其表面可通过离子键与带负电荷的小分子结合.由于其表面的亲水特性和可通过其它交联剂共价结合的能力,可用于固定溶于Triton-100、Tween 20等去污剂的蛋白分子.该类板的缺陷为由于降低了疏水性,一部分蛋白分子无法结合;此外,其表面需有效的封闭.由于亲水和共价的表面特性,使用封闭液必须能够与非反应性氨基集团和所选择的交联剂中任何官能基团如succinimide、aldehyde和maleimide发生作用。

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聚氯乙烯:
聚氯乙烯与聚苯乙烯是类似的塑料，也可作为ELISA固相载体，聚氯乙烯板的特点为质软板薄，可切割，价廉、但光洁度不如聚苯乙烯板。
聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值有时也略高。

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UV分析板(紫外光分析板)
聚苯乙烯和聚氯乙烯板在紫外区有很强的吸收不能用于蛋白核酸的定量。
Uv分析板可直接读取核酸及蛋白的浓度
在260nm/280nm低本底干扰
UV板价格昂贵一般在150RMB左右

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抗原和抗体
抗原和抗体的质量是实验是否成功的关键因素。本法要求所用抗原纯度高，抗体效价高、亲和力强。
天然抗原:（天然抗原取材于动物组织或体液、微生物培养物等，一般含有多种抗原成分，需经纯化，提取出特定的抗原成分后才可应用，因此也称提纯抗原（purifiedantigen）。
重组抗原:
合成多肽抗原: 重组抗原（recombinant antigen）和多肽抗原（peptide antigen）均为人工合成品，使用安全，而且纯度高，干扰物质少。

多克隆抗体
单克隆抗体
抗血清成分复杂，应从中提取IgG才可用于包被固相或酶标记。含单克隆抗体的小鼠腹水中的特异性抗体含量较高，有时可适当稀释后直接进行包被。制备酶结合物用的抗体的质量往往要求有较高的纯度。经硫酸铵盐析纯化的IgG可进一步用各种分子筛层析提纯。也可用亲和层析法提纯特异性IgG，如用酶消化IgG后提取的Fab片段，则效果更好。