噬菌体抗体库技术--鼠源性噬菌体ScFv抗体库的构建

黄帮主

scFv单链抗体（Single-chain variable fragment），是由抗体重链可变区（heavy chain variable domain，VH）和轻链可变区（light chain variable domain，VL）通过一个由10-25个氨基酸组成的柔性短肽（linker）连接而成，约27 kDa左右。
传统抗体库都是通过噬菌体外壳蛋白Ⅲ或蛋白Ⅷ融合单链抗体(ScFv)的形式展示于噬菌体表面，继而通过多轮的抗原淘选可获得完全人源的单链抗体(ScFv)。
scFv实现了从研究到各种疾病的诊断和治疗的广泛应用。它们的特异性和低免疫原性使它们成为传统治疗形式的一种很好的替代方法，提高了靶向特定分子的准确性并避免了不良副作用。

黄帮主

STEP 1:  小鼠免疫和脾细胞RNA提取 RT获得第一链cDNA

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黄帮主

STEP 2:小鼠ScFv单链抗体基因的获得

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黄帮主

STEP 3: TG1电转感受态的制备

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hao9116073

黄帮主 发表于 2020-12-10 11:48
STEP 2:小鼠ScFv单链抗体基因的获得
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黄总你好，我是新手菜鸟在努力学习。
请问，为什么扩增全长的时候sfiI酶切位点GGCC后面会单独加上ATGGCC 六个碱基

黄帮主

hao9116073 发表于 2023-2-27 17:05
黄总你好，我是新手菜鸟在努力学习。
请问，为什么扩增全长的时候sfiI酶切位点GGCC后面会单独加上ATGGCC ...

看红框标记处，重叠延伸时所用上游引物和扩增VH的上游引物的恒定序列一致。

hao9116073

黄帮主 发表于 2023-2-27 22:47
看红框标记处，重叠延伸时所用上游引物和扩增VH的上游引物的恒定序列一致。

谢谢黄总百忙之中回复我这个小菜鸟。
看SfiI酶切位点在VL左边，这个作者应该 VL+linker+VH 插入的表达载体。
红色框里应该是SfiI酶切位点+ATGGCC
而一般的推荐引物都是VH+linker+VL  比如通用实验验指南，也是酶切位点紧跟ATGGCC。
这个ATGGCC是起始密码子，还是VL和VH的共同保守序列？
我查了一下这个载体图谱前面有g3信号肽 ，酶切位点后面有6个NNNNNN，也没具体说明。
另外一个质粒说这个可能是peiB信号肽。
新手上路，一头雾水

黄帮主

根据自己的实验目的选择VH-VL或者VL-VH拼接Scfv，哪种方向都可以。


pCANTAB 5E  载体上的NNNNNN代表的是VH或者VL基因，是个虚数，不是指恰好6个核苷酸。
pHEN4载体上的pelB信号肽序列正好包含Sfi I酶切位点，翻译后序列MKYLLPTAAAGLLLLAAQPA，促进蛋白可溶性表达，进入细胞周质空间，后续纯化也简单。
噬菌粒载体很多种，多分析几个示意图，需要加什么标签蛋白，linker，或者酶切位点之类的，自己也可以根据实验需要进行改造。

hao9116073

黄帮主 发表于 2023-2-28 23:33
根据自己的实验目的选择VH-VL或者VL-VH拼接Scfv，哪种方向都可以。

多谢黄总解惑