Identification of a Neutralizing Monoclonal Antibody That Recognizes a Unique

傲慢与偏见

Identification of a Neutralizing Monoclonal Antibody That Recognizes a Unique Epitope on Domain III of the Envelope Protein of Tembusu Virus

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论文摘要：
EDIII蛋白是黄热病毒产生的中和抗体主要靶标蛋白。
坦布苏病毒在2010年首次从鸭体内分离得到的病毒，单抗12F11是用坦布苏病毒重组蛋白rEDIII免疫小鼠后，通过杂交瘤技术获得的单抗。
中和试验显示能有效抑制病毒在BHK-21细胞上生长，噬斑减少实验也证实单抗12F11具有中和活性。
通过构建一系列截断蛋白，用WB进行检测，发现12F11识别表位在Diii蛋白的8-77位。
功能性实验证实抗体中和病毒主要是在病毒的吸附阶段。

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坦布苏病毒，黄病毒成员，最初是1955年在马来西亚分离而得，2010年，中国东部在鸭群中呈现爆发流行，后来的六个月，迅速传播到中国南部，中部，北部，给养殖业带来重大损失。
和其他黄病毒属成员一样，E蛋白在病毒生命周期中发挥重要作用，在细胞感染阶段，E蛋白和受体结合，介导膜融合。E蛋白是黄热病毒中和抗体的重要靶蛋白。
中和抗体和E蛋白结合后，能直接抑制病毒和受体结合，抑制内吞作用和膜融合。
E蛋白分为三区，其中大多数中和表位集中在EDIII区。
目前，国内关于TMUV的研究进展有：
TMUV E蛋白能诱导产生保护性免疫反应。
针对TMUV E蛋白筛选到几株单抗，其中两株3E9和1G2具有中和活性。
在EDII区( 87–91和221–225)和DIII区（374-380）鉴定到三个中和表位，其中1G2的识别表位定位在EDII的hi-环。
本研究中，针对EDIII蛋白，通过杂交瘤技术获得一株12F11抗体，对其生物特性和表位鉴定进行了一系列实验研究。

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实验材料：
BHK-21细胞，DMEM，
TMUY病毒株，2014年从鸭体内分离，在9日龄鸭胚蛋上进行增殖，BHK-21细胞上放大培养。
噬斑计数确定病毒滴度。
取20000pfu的病毒肌肉注射1周龄鸭，7天后取存活的鸭子血，制备阳性血清。

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制备DIII蛋白
毒株E基因序列参考 (GenBank Accession No. MK542820) ，DIII区预测根据conserved domain database (CDD)而得，长109个aa，对应E蛋白的298-406位。
DIII蛋白二级结构参考同属其他病毒，预测有7个β-折叠。
分子量大小通过在线预测 (https://web.expasy.org/protparam/)，为11.7kda。
原核表达载体选用 PET-28a。
表达的DIII蛋白在N端有一个his标签，用于蛋白纯化。

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坦布苏病毒EDIII蛋白预测为109aa，即E蛋白的298-406位氨基酸，大小约为11.7KDa。
DIII蛋白的二级结构可能由7个β-折叠组成。
原核表达后，SDS-PAGE显示除了预期的一个16.7kda的主带外，还有一个15.8kda的条带，WB显示都能和抗HIS单抗以及抗-TMUV多抗结合，此外还检测到一个30kDa的条带，经过质谱分析，16.7kda的条带是1-109位的EDIII蛋白，15.8kDa的条带是2-102位aa，30kDa的条带含有2-93位aa。

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DIII基因序列如下（327bp）：
aaaggaatgacctacccgatgtgtagcaacacattttccctagtgaagaatcctaccgacactgggcatggcactgtcgtggtggaattgtcttatgcaggtaccgatgggccctgtagagttcccatatccatgtcggcagatctgaatgacatgacaccagttggacgcttgataacagtcaacccatacgtgtcgacctcctccacgggtgccaagataatggtggaagtggaacctccattcggggattcattcatcttagtagggagtgggaaaggacagatcaggtaccagtggcatagaagtgggagcacaattggaaaa文中设计的引物：
1f CGCGGATCCAAAGGAATGACCTACCCGATGTGTAGC (BamH I)
109.1r a CCGCCTCGAGTTTTTCCAATTGTGCTCCCACTTCTATG
XHO I酶切位点后的T似乎是多出了一个，这样造成后续的移码，去掉后可能会改善蛋白条带不唯一的问题。

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单抗制备
皮下注射免疫6周龄小鼠，免疫三次，间隔14天，每次DIII蛋白用量为50ug/次/只
三免后抗体滴度能达到1:10,000, 最后一次加强免疫，100ug/只，三天后取脾，和SP2/0融合。通过杂交瘤技术获得一株抗DIII的单抗12F11。分型鉴定为IgG1型。
腹水中抗体滴度约为1：4×10^6。
WB实验鉴定能和重组DIII蛋白以及病毒颗粒结合（图A：重组蛋白，图B：病毒颗粒）
IFA实验鉴定能和病毒结合。（图C：病毒感染BHK-21细胞后IFA鉴定）

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中和实验：
首先检测12F11是否具有中和活性，
100ul的腹水原液和10000pfu的病毒预混，孵育1小时后感染BHK-21细胞。可见加入抗体的实验组能有效抑制病毒感染细胞时CPE发生，IFA实验同样验证了12F11对病毒的中和作用。

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PRNT噬斑减少中和实验：
将12F11 Mab段纯化出来，梯度稀释，进行噬斑减少实验。抗体浓度为500ug/ml的实验组噬斑产生量为15±3，而未加抗体的对照组噬斑产生量为89±1.
结果如图，12F11能有效减少病毒噬斑产生，半数减少噬斑的抗体浓度为36ug/ml。