Development of Anti-Yersinia pestis Human Antibodies with Features Required ...

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Development of Anti-Yersinia pestis Human Antibodies with Features Required for Diagnostic and Therapeutic Applications 202009
人抗鼠疫耶尔森菌的研制--具有诊断和治疗应用所需特征的抗体
This article was published in the following Dove Press journal:  ImmunoTargets and Therapy

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背景：
鼠疫耶尔森氏菌是一种A类感染性物质，可引起腺鼠疫、败血症型和肺鼠疫。值得注意的是，通过自然或有目的手段获得抗菌素或多药耐药性使鼠疫杆菌成为一种潜在的生物威胁剂。因此，为准确和灵敏地诊断鼠疫耶尔森氏菌而设计的高质量抗体，以及强化或取代传统抗生素的治疗方法，对于国家安全和公共卫生准备是极其必要的。

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方法：
在这里，我们描述了一组针对鼠疫杆菌组分1(F1)抗原的人源单克隆免疫球蛋白(IgG1)，该抗原以前是由单链抗体库(ScFv)在体外优化而来的。我们通过ELISA、流式细胞术、质谱、光谱分析和各种代谢分析，广泛地表征了这些抗体及其对细菌和哺乳动物细胞的影响。

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结果：
我们的两个抗F1抗体(αF1Ig 2和αF1Ig 8)在产量、特异性和稳定性方面表现突出。这两种抗体还具有额外的吸引力，因为它们表现出皮摩尔亲和力，在与鼠疫杆菌结合时不竞争，在化学衍生时保持免疫反应性。最重要的是，这些抗体在夹心ELISA中检测到<1,000个鼠疫细胞，不损害呼吸道上皮细胞，在低浓度(350 NM)诱导鼠疫菌凝集，在非凝集浓度(34 NM)放射性标记时明显抑制细胞生长

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结论：
这些抗体有助于发展准确和灵敏的诊断和免疫/放射免疫疗法。

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方法：
菌株制备
鼠疫耶尔森氏菌A1122和炭疽芽孢杆菌Sterne是从洛斯阿拉莫斯国家实验室的存档培养物中获得的。假结核杆菌ATCC 27,802和荧光假单胞菌ATCC 13,475取自美国组织培养库。
F1阳性鼠疫菌在含2.5 mM CaCl2的BHI培养基中37℃培养。F1阴性鼠疫耶尔森氏菌在23°C无CaCl2的条件下生长。

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抗F1抗体：
抗F的单链抗体通过将VH\VL氨基酸序列插入到IgG骨架转换成IgGs
得到的蛋白序列被提交给美国纽瓦克ATUM公司，进行密码子优化的回译、基因合成，并作为全长IgG1抗体在HEK293细胞中表达。
在各种结合试验中，用美国长滩高级免疫化学公司的商品化抗F1 YPF19作为阳性对照，以天然人IgG1)作为阴性对照，抗流感M2 scFv59的scFv和IgG形式也被用作阴性对照

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生物素标记F1抗原的制备：

NHS LC-LC生物素化试剂盒(Thermo

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基于酵母展示的单链抗体筛选：
利用酵母1试剂盒(Sigma-Aldrich)将用限制性内切酶BssH II、Nhe和Nco I(NEB)酶切的酵母载体和scFv片段共转化酵母细胞，通过缺口修复？？进行克隆。
用抗SV5-PE标记60个酵母细胞以评估scFv展示水平。
用Alexa 633标记的链霉亲和素检测生物素化蛋白的结合。

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通过ELISA对抗体进行鉴定：
1总体方案：
ELISA检测抗体结合活性，商品化抗F1抗体阳性对照，抗炭疽阴性对照
2细胞表达F1亲和力的测定：AB=ABmax×[A]/(Kd+[A]，式中AB=抗体结合，ABmax=最大抗体结合，[A]=初始抗体浓度，Kd=抗体解离常数。
3ELISA检测结合表位
4夹心酶联免疫吸附试验检测细胞的极限？？
5抗体稳定性的测定
浓度分别为0.5 mg/mL(αF1Ig2)和2.7mgmL(αF1Ig8） 37℃ 分别于1w2w3w取出