细菌相关操作

黄帮主

LPS的制备：
采用热酚水法提取。
① 将收集的细菌自-20 ℃取 出，-80 ℃ 反复冻融3次；
② 超声破碎(温度 26℃，功率 350W，超声5S，间隔 9S，共 70 次)。
③ 将裂解的菌液置 4 ℃ 过夜 。
④ 裂解的菌液加入等量的90％苯酚，于68℃水浴中摇动30min；
⑤ 5500r/min 离心20min，收集水相，弃变性蛋白质。
⑥ 将下层菌体沉淀加等体积的水混匀 ， 于 68 ℃水浴中重复上述操作两次。
⑦ 将 3 次收集的水相放入透析袋中用自来水透析 24 h，换用三蒸水透析 48 h， 期间换水5-6 次 ；
⑧ 透析物用聚乙二醇 20000 浓缩至原来体积的 1／4 ， 离心取上清即得 LPS 粗产物 。

黄帮主

10004：
布氏杆菌LPS的提取：
灭活的布氏杆菌 ，湿重约 50 mg，粗提 LPS。将沉淀进一步纯化。
用 20 mL 水重悬，加入 RNA酶(0.01 mg/mL)、DNA 酶Ⅰ (0.01 mg/mL) 37 ℃孵育
30 min，加入蛋白酶 K (0.15 mg/mL) 55 ℃ 3 h 后，室
温过夜。吸取样品进行 SDS-PAGE 电泳及银染色[8-9]
鉴定。分装后冻干保存

黄帮主

10004：
细菌抗血清的制备
取细菌用 PBS 调整浓度至 10^9 个 /mL， 80 ℃水浴灭活 3 h(毒性大的菌需要在P3实验室进行)。间隔3周，背部皮下多点注射，免疫家兔2只，3次免疫后采集血清备用。

黄帮主

霍乱弧菌LPS的提取：
霍乱弧菌在2XY培养基中进行培养，当OD600达到0.7时, 5,000 rpm离心；
每克的菌，加入65℃预热的水溶液17.5ml；
然后加入等体积65℃预热的90%酚溶液；
剧烈搅拌，温度保持在65℃，冰上放置降温。
4℃，3000rpm离心45分钟，将上层水相转移到3.5kDa的透析袋中；
透析置换到PBS培养基中，最后透析置换到水中，抽真空冻干，-20℃保存。
用16 % 三羟甲基甘氨酸-SDS-PAGE进行电泳和银染。