5型和35型腺病毒纤毛蛋白的 原核表达及活性验证

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5型和35型腺病毒纤毛蛋白的 原核表达及活性验证

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摘要
目的：原核表达5型腺病毒纤毛蛋白(Ad5 fiber)和35型腺病毒纤毛蛋白(Ad35 fiber)，并对蛋白活性进行初步分析。
方法：将重组质粒pET28a-Ad5 fiber和pET28a-Ad35 fiber转化入E．coli BL21(DE3)，IPTG诱导表达后，经Ni—NTA凝胶珠亲和纯化，用SDS—PAGE鉴定纯化蛋白．并用蛋白竞争性实验验证纯化蛋白的活性。
结果：转化溶原菌后能够表达目的蛋白，Ad35 fiber蛋白对Ad5(5型腺病毒)感染无影响，只能阻断Ad5F35(5型腺病毒纤毛被替换为35型腺病毒纤毛
的嵌合腺病毒)对细胞的感染；Ad5 fiber蛋白对嵌合腺病毒Ad5F35感染无影响，只能抑制Ad5对细胞的感染。
结论：成功表达具有生物活性的5型和35型腺病毒纤毛蛋白，为进一步研究嵌合腺病毒Ad5F35感染细胞的机制奠定基础。

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背景摘要：
腺病毒的纤毛由尾巴(tail)、杆(shaft)、头节(knob)3部分组成，在感染细胞过程中发挥重要的作用，腺病毒感染细胞的过程开始于纤毛的头节结合细胞表面的特异性受体，不同血清型的腺病毒所识别的细胞表面受体存在较大差异 。

目前体外基因修饰T细胞的常用载体为逆转录病毒载体 ，但是逆转录病毒因其整合基因组的特性，从生物安全的角度不适于临床应用。
腺病毒载体因具有能感染增殖和非增殖细胞、不整合宿主细胞基因组、能同时表达多个外源基因等优点，已逐渐在TCR基因修饰的T细胞过继治疗中发挥重要作用 。
有关腺病毒载体感染T细胞的分子机制研究，可为用于临床治疗的腺病毒载体研发提供理论基础。

目前最常用的腺病毒载体是血清型5型腺病毒(Ad5)，其感染细胞表面天然受体为柯萨奇受体(coxsackie receptor，CAR) 。
T淋巴细胞因柯萨奇受体(CAR)表达水平低，导致5型腺病毒载体转染T细胞效率较低 。
35型腺病毒结合细胞的天然受体为CD46，CD46分子在T淋巴细胞中有较高水平表达 。因此将5型腺病毒中编码纤毛头节和杆区部分的基因进行替换重组，形成具有35型腺病毒纤毛杆和头节的嵌合型腺病毒载体Ad5F35。
该嵌合病毒通过结合细胞表面的CD46分子感染细胞，能够明显提高病毒转染T淋巴细胞效率 。

Ad5 fiber基因编码区长度为588个碱基，编码蛋白为196个氨基酸；Ad35 fiber基因编码区长度为840个碱基，编码蛋白为280个氨基酸。
本文通过原核表达、纯化5型(Ad5)和35型(Ad35)腺病毒纤毛蛋白，通过纤毛蛋白竞争性抑制病毒感染实验，验证所表达纤毛蛋白的活性，为下一步通过免疫共沉淀方法研究Ad5F35感染细胞的机制奠定基础。

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实验材料：
Jurkat细胞(T淋巴瘤细胞株)，293细胞。
原核表达载体pET-28a（Novagen），骨架载体pBHGloxdelE13（Microbi公司）、穿梭载体pDC315（Microbi公司），Ad5f35骨架载体（实验室自制）
TC—C18反相柱购自Agilent公司； 高效液相系统(High Performance Liquid Chromatograph，HPLC)为Waters公司产品
流式细胞仪Epics—XL，Beckman Coulter公司。

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Ad5和Ad35纤毛基因的扩增和原核表达载体的构建
采用以下一对引物扩增Ad5 fiber的基因，扩增片段609bp，
上游引物5'-CCG GAA TTC ATG GGT GCC ATT ACA GTA GGA AAC-3'
下游引物5'-CCC AAG CTT TTA TTC TTG GGC AAT GTA TGA-3'
通过ECoRI和Hind III酶切位点插入到pET-28a中，卡那霉素抗性筛选，得到的质粒pET-28a-Ad5 fiber序列如附件。

采用以下一对引物扩增Ad35 fiber的基因，扩增片段864bp，
上游引物5'-CCG GAA TTC ATG GGA GTT CTT ACT TTA AAA TGT-3'
下游引物5'-CCC AAG CTT TTA GTT GTC GTC TTC TGT AAT-3'
通过ECoRI和Hind III酶切位点插入到pET-28a中，卡那霉素抗性筛选，得到的质粒pET-28a-Ad35 fiber序列如附件。

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Ad5 fiber蛋白理论值大小为26KDa
Ad35 fiber蛋白理论值大小为32.5KDa

其中可见AD35 fiber包涵体比较多（第8道），不过也有少量可溶性表达。
两种蛋白纯化后经过HPLC分析，蛋白主峰纯度均大于90%。

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Ad5和Ad35纤毛蛋白对腺病毒感染细胞的抑制作用
1. 以1640完全培养液重悬Jurkat细胞（该细胞为悬浮细胞)，按照5x10^5/孔密度接种于6孔细胞培养板。
2. 按照终浓度0ug/ml，0.1ug/ml，lug/ml，10ug/ml，50ug/ml分别加入重组蛋白Ad5 fiber和Ad3 fiber，室温孵育30min。
3. 以感染复数( multiplicity of infection，MOI)MOI＝100分别加入腺病毒Ad5-GFP，Ad5F35-GFP，置于细胞培养箱内培养1h。
4. 800g离心5min，弃上清;
5. 加入1640完全培养液，置于细胞培养箱内培养48h。
6. 流式细胞仪检测表达GFP的阳性细胞比例。

Ad35fiber蛋白对Ad5病毒感染细胞无影响，只能阻断Ad5F35对细胞的感染，并且随着Ad35fiber蛋白浓度增高而抑制效果越明显，当Ad35 fiber蛋白终浓度为50ug/ml时，Ad5F35大约50％的转染被抑制。
Ad5 fiber蛋白对Ad5F35病毒感染细胞无影响，只能阻断Ad5对细胞的感染，并且随着Ad5fiber蛋白浓度增高而抑制效果越明显，当Ad5 fiber蛋白终浓度为50ug/ml时，Ad5的转染全部被抑制。
说明两种蛋白识别的受体不同，并且可能在Jurkat细胞上，Ad5F35的受体CD46分子比Ad5的受体CAR要多，所以需要更大量的Ad35 fiber结合从而抑制病毒的感染。

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讨论部分摘要：
Ad5F35嵌合型腺病毒的成功构建，有效地提高病毒转染T细胞的效率。
以前实验认为：Ad5F35转染效率和CD46表达高低无关联，CD46抗体只能部分阻断Ad5F35对细胞的转染。
现在认为：可能还有其他受体分子和Ad5F35结合，实现病毒对细胞的感染。
纤毛蛋白Fiber主要通过识别宿主细胞上的特异性受体而使病毒吸附结合在宿主细胞上，有助于病毒的侵入和内化，因此，对Fiber蛋白的研究对于了解病毒的感染，致病机制，以及诊断有重要意义。