一株乙型肝炎病毒鼠单抗的人源化及生物学活性鉴定

米小圈

一株乙型肝炎病毒鼠单抗的人源化及生物学活性鉴定

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摘要：
目的：乙型肝炎病毒(HBV)感染是全球最为重要的公共卫生问题之一，目前临床上治疗HBV的药物在彻底清除病毒方面并没有取得满意的结果，因此迫切需要发展能有效清除病毒，尤其是能有效清除乙肝表面抗原(HBsAg）或大幅度降低HBsAg血清学水平的创新性治疗药物。
方法：筛选到一株针对HBV和HBsAg上一个特定表位的鼠单抗129G1，它能持续有效地清除转基因小鼠体内的HBV及HBsAg，有发展为治疗性抗体药物的潜力．为了降低129G1的免疫原性，采用互补决定区（CDR）移植的方式，利用噬菌体抗体库技术对这个鼠单抗进行了人源化，最终得到人源化抗体。
结果：人源化抗体与HBsAG的结合活性与嵌合抗体相当，抗体质量浓度为1.45μｇ/ml时介导THP-1细胞吞噬率达到50％．在HBV转基因小鼠的实验中，获得的129G1人源化抗体能持续有效地抑制血清中HBV DNA及清除HBsAg。

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背景资料：
全球约20亿人感染过HBV，占世界人口的1/3，每年约100万人死于HBV感染及其引发的肝脏疾病。
临床上药物包括干扰素类和核苷类似物。HBsAg的血清阴转率前者仅有7.8%，后者不足2%。治疗性单抗，靶向治疗，特异性高，均一性好，疗效强，副作用小。
HBC感染宿主后产生的抗体主要是anti-HBs，anti-HBe，anti-HBc，其中anti-HBs属于能够有效阻止病毒感染细胞的中和抗体，可以作为有效治疗慢性乙肝的药物。
目前，高效价HBIG乙肝免疫球蛋白广泛应用于阻断HBV的母婴垂直传播，但是对于慢性感染未见疗效，并且由于血浆来源和性质稳定性存在一定的安全问题。

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所用材料：
一株通过杂交瘤技术获得的鼠抗129G1，针对HBsAg抗原。
ER2738菌株（NEB)
PTT5真核表达载体
噬菌体展示载体pCGMT
表达细胞株FLP IN CHO
HBsAg乙肝表面抗原定量试剂盒

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鼠单抗129G12的治疗效果评价：
筛选到的129G12在HBV转基因小鼠中评估治疗效果，10mg/KG的剂量注射到小鼠体内。
每天取血清，监测其中HBsAg（化学发光法检测）和DNA水平（荧光定量PCR）的变化情况。


鼠单抗129G1注射小鼠体内后，小鼠血清中的HBV DNA及HBsAg水平均会明显下降，说明单抗129G1在小鼠体内具有清除病毒、抑制病毒扩增的生物学活性；
单剂量注射鼠单抗能有效抑制血清中HBsAg达３d，持续有效抑制血清中的HBV DNA达10ｄ左右，说明这株鼠单抗在HBV转基因小鼠体内有良好的病毒及HBsAg清除能力。

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鼠单抗129G1表位鉴定：
参考HBsAg 氨基酸序列
menitsgflgpllvlqagfflltriltipqsldswwtslnflggaptcpgqnsqsptsnhsptscppicpgyrwmclrrfiiflfilllclifllvlldyqgmlpvcpllpgtsttstgpcktctipaqgtsmfpsccctkpsdgnctcipipsswafarflwewasvrfswlsllvpfvqwfaglsptvwlsviwmmwywgpslynilspflpllpiffclw
从第１位氨基酸开始，每15个氨基酸合成１条短肽，短肽之间互相重叠，重叠处为７个氨基酸，共计27条。

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进一步用27条合成肽来鉴定鼠单抗的抗原识别表位。ELISA检测结果，只有S18与鼠单抗129G1有结合，其他肽段不结合。
S18肽序列为CCCTKPSDGNCTCIP，位于HBsAg氨基酸序列的第137-151位。

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鼠单抗129G1的人源化
提取129G1杂交瘤细胞株的总RNA，RT-PCR得到VH和VL片段并且测序。
用IMGT抗体分析数据库分析得到抗体的轻重链CDR1-3序列。
NCBI BLAST搜索基因数据库，在查找框中输入鼠单抗129G1重链可变区VH和和轻链可变区VL的氨基酸序列，系统自动搜索与鼠单抗129G1的VH和VL同源性最高的人源抗体可变区的氨基酸序列，从而确定了与鼠单抗129G1的FR同源性最高的人胚系基因的VH和VL序列。

最终确定以Human１-69-02及Human１-9-01胚系基因序列分别作为鼠单抗129G1人源化改造的重链和轻链FR模板。

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通过CDR移植和噬菌体展示相结合的方法对鼠单抗129G1进行人源化：
将129G1的6个CDR序列移植到这２个选取的人胚系基因的FR中，多种方法分析人抗胚系基因的FR与鼠单抗129G1的FR区中氨基酸的差异。性质差异大的氨基酸替换容易影响到人源化抗体的活性，因此针对这些位点的氨基酸差异设计一个多样化重组的抗体序列库。
对于不重要的氨基酸直接进行人源替换，对于一些靠近CDR的重要氨基酸及同一位点性质不同的氨基酸可以选择人，鼠两株替换方式。
通过简并引物在这些氨基酸位点引入鼠源及人源氨基酸２种替换，采用重叠延伸PCR的方式获得重组抗体DNA片段库，将其克隆至噬菌体载体中，从而获得噬菌体ScFv库。
在FR有33个位点设计了２种氨基酸的替换，其中重链18个，轻链15个，因此129G1人源化ScFv库的氨基酸序列多样性理论上为2^33≈5.37×10^8。

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噬菌体ScFv库的构建、筛选及检测
根据选取的人胚系基因FR 碱基序列设计PCR引物，并在突变位点设计简并引物，VL和VH之间用短肽（GGGGS)3连接，采用重叠延伸PCR的方法获得
129G1人源化单链抗体库基因片段，克隆到噬菌体展示载体pCGMT中，构建噬菌体ScFv库。
采用固相筛选的方法进行重复的３轮“吸附—洗脱—感染—扩增”富集筛选。ELISA检测噬菌体单链抗体与HBsAg的结合活性
有５株人源化噬菌体单链抗体（129G1-36，45，59，75，81）显示与HBsAg有很强的结合活性，与鼠单抗129G1 的噬菌体单链抗体结合活性相当。