Efficient induction of cross-presentating human B cell by transduction with...

cl181117

Efficient induction of cross-presentating human B cell by transduction with human adenovirus type 7 vector

cl181117

摘要：
人类自体B细胞易于大规模制备，可成为树突状细胞的一种很有前途的替代品，不过其缺陷在于人幼稚B细胞抗原提呈能力较差。人腺病毒7(HADV7)活疫苗安全有效的使用记录使其成为有前景的疫苗载体候选物。
本研究构建了编码绿色荧光蛋白(GFP)和癌胚抗原(CEA)的E3缺陷型重组HADV7载体，可有效地转导人B细胞，重组HAdV 7可激活MAPKs/NF-B通路。
检测到细胞因子TNF-α、IL-6和IL-10、表面分子MHC-Ⅰ和CD 86、抗原处理(APM)复合物ERp 57、TAP-1和TAP-2在HAdV 7转导的人体B细胞内得以上调。
我们还发现，CEA特异性IFNγ的表达、脱颗粒以及体外和体内外的细胞毒性是由HAd7CEA修饰的人B细胞诱导的自体CD8 T细胞诱导的。同时，我们的证据清楚地表明，Toll样受体9(TLR 9)拮抗剂IRS 869显著消除了大部分HADV7启动的B细胞活化和CD8 T细胞应答。 表明TLR 9信号在HAdV 7诱导人B细胞交叉表达中的具有关键作用。除了更好地理解重组HAdV 7与人B细胞之间的相互作用外，本研究提供了支持使用HAD7修饰的B细胞作为疫苗和免疫治疗的载体的第一个证据。

cl181117

背景介绍：
专业抗原呈递细胞(APCs)主要有三种：巨噬细胞、树突状细胞(DC)和B细胞其中，DC在抗原提呈与T细胞活化中具有更重要的作用，一直以来，大多数研究集中在DC上。但是在树突细胞免疫疗法中，会受到培养过程复杂、实验试剂昂贵和缺乏足够的DC细胞数的影响。
相反，自体B细胞可以容易地从病人的血液中获得，此外，与DCs不同，静脉内给药的B细胞容易迁移到次级淋巴组织中的免疫诱导位点。因此，B细胞作为细胞疫苗开发更有前景。

然而，幼稚B淋巴抗原递呈能力较差，可能是由于细胞表达共刺激分子的能力较差。有研究表明，TLR 9激动剂CpG ODN能激活幼稚B细胞，促进共刺激分子和MHC分子的表达，提高细胞抗原呈递功能。因此，TLR9激活和抗原基因递送联用的新策略有望诱导B细胞交叉递呈反应和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应。

以往的研究证实腺病毒可以通过TLR 9识别病毒DNA诱导APCs成熟，并发现TLR 9通路被识别CD46受体的腺病毒优先激活。 人腺病毒7型(HAdV 7)是一种识别CD 46的腺病毒，对于活化B细胞有效。
并且，食品和药物管理局(FDA)批准的非减毒HAdV 7活疫苗已经使用了超过25年，保护1000多万美国新兵预防急性呼吸道疾病(ARD)，降低发病率约50%。HAdV 7作为一种很有前途的疫苗载体，具有良好的安全性和有效性。
以HAdV7为载体构建的用于抗人类免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、呼吸道合胞病毒(RSV)和H1N5的黏膜或系统重组疫苗多有报道，重组HAdV 7可以将载体编码抗原传递给APC。
因此，我们认为如果 HAdV 7能有效地将抗原编码基因传递给人幼稚B细胞，TLR 9激活的B细胞反过来能交叉递呈现载体编码的抗原，诱导抗原特异性CTL反应。

为了探索这种可能性，我们构建了编码绿色荧光蛋白(GFP)和癌胚抗原(CEA)的E3缺陷重组HAD7载体。我们证明了幼稚的人B 通过重组 HAdV 7载体在体外有效转导和活化。我们研究了重组HAd7CEA介导的人幼稚B细胞对自身CD8 T细胞的处理和表达能力。我们还观察了HAd7CEA修饰的B细胞诱导的CEA特异性CD8 T细胞体外和体内外细胞毒性。同时，我们也提供了 TLR 9在重组HAdV 7激活人幼稚B细胞APC功能中发挥重要作用的证据。

cl181117

实验材料：
HAdV 7 WZ1株，从一名ARD患儿中分离出来的。该病毒株感染性克隆pMD18TAd7LR
从中国菌种收藏中心(武汉，中国)获得。IRS869，为TLR9的抑制剂。
A549、SW 480(HLA-A2+/CEA+)、MCF-7(HLA-A2+/CEA-)和LoVo(HLA-A2-/CEA+)细胞系。
雌性CB.17 SCID小鼠(6-8周)，SPF级

知识就是力量

7型腺病毒感染性克隆和表达GFP/CEA复制型载体

同源重组的方法构建
复制载体有完整的表达GFP/CEA表达框CMV-GFP/CEA-SV40 POLYA。
用PME I释放出来病毒基因组后，转染A549细胞，能获得重组病毒。PME I酶切位点在HADV7基因组中有有三处存在，避开这些位点做到不完全酶切还是挺难的

知识就是力量

从人外周血中分离幼稚B细胞
用Ficoll-Plaque PLUS分离液对PCR鉴定的HLA-A2阳性，腺病毒感染阴性的健康人全血进行分离，收获抗凝全血离心分层中位于血浆和红细胞之间的一层，主要为血小板或者白细胞。
用B细胞分离和CD8+T细胞分离试剂盒分离收获幼稚B细胞和CD8+ T细胞。