Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real- Time Quantitative PCR

真核表达

Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2-▲▲CT Method

真核表达

摘要：

用于分析实时定量PCR 实验数据的两种常用方法是绝对定量和相对定量。
绝对定量是通过标准曲线计算起始模板的拷贝数；
相对定量方法则是比较经过处理的样品和未经处理的样品靶标转录本之间的表达差异。
2^－△△CT方法是实时定量PCR 实验中能用于检测基因表达相对变化的一种简便的分析方法。
本文介绍了该方法的推导，假设及其应用。另外，还介绍了两种2^－△△CT衍生方法的推导和应用，也可以运用到实时定量 PCR 数据分析中。

关键词：反转录 PCR，定量 PCR，相对定量， 实时 PCR， Taqman

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    反转录 PCR （RT-PCR）是基因表达定量中非常常用的一个实验技术，实时PCR 技术和RT-PCR结合形成的反转录定量 PCR 技术，更为实用，准确。
    分析实时定量PCR实验数据的方法主要有两种：绝对定量和相对定量。
    绝对定量一般通过绘制标准曲线来准确定量要研究的转录本的拷贝数，通常在需要确定转录本绝对拷贝数的条件下使用。
    相对定量方法则是分析靶基因转录子的数量变化倍数，比如：实验组是进行处理的组别，对照组可以是未进行处理的组别，或者是时间进程研究中对实验组的零点和不同时间点进行比较等，比较不同样本中转录本之间的表达差异或是在不同时相中的表达差异。
    在有些情况下，并不需要对转录本进行绝对定量，只需要给出相对基因表达差异即可。比如，我们说基因X 在经过某种处理后其表达量增加 2.5 倍，比说该基因的表达从1000拷贝/ 细胞增加到2500 拷贝/细胞更加直观。

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运用实时荧光定量PCR 对基因表达变化进行相对定量分析时，需要使用特定的公式、假设以及对这些假设的验证。
2^－△△CT方法是其中的一个分析方法，可用于计算基因表达的相对变化。
2^－△△CT公式的推导，包括假设，实验设计以及有效性评估，在AppliedBiosystems User Bulletin No.2（P/N4303859）手册中有详细介绍。
本研究进一步介绍该方法的推导、假设以及应用，此外进行两种衍生方法的推导和应用，它们在实时定量PCR 数据分析中都可能被用到。

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2-▲▲CT方法的推导
【1】PCR指数扩增的公式
其中X0 是初始靶分子数，Xn 是第 n 个循环后的靶分子数， Ex 是靶分子扩增效率，n是循环数。
【2】 定义Ct 为靶分子扩增产物达到设定阈值时所经历的循环数。Xt是靶分子达到设定的阈值时的分子数，则Ctx 是靶分子扩增达到阈值时的循环数，Kx是一个常数。
【3】对于内参基因而言，也是和【2】同样的公式。Kr 也是一个常数。
【4】用Kx除以KR 得到的数值也是一个常数。
对于使用 Taqman 探针的实时定量PCR而言， Kx和KR的值由一系列因素决定：包括探针所带的荧光报告基团、探针序列对探针荧光特性的影响、探针的水解效率和纯度以及荧光阈值的设定。因此常数K并不一定等于1 。

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【5】假设目标基因和参照基因扩增效率相同，Ex=Er=E，由【4】可以推论得到【5】
【6】令Xn=Xo/Ro，由【5】简化到【6】ΔCt=靶基因和参考基因的Ct值之差。
【7】【6】变换为【7】
【8】q为任意样品，cb为校准品。两者的X相除，得到公式【8】
【9】对于PCR小于150bp的片段，缓冲液的镁离子和引物浓度进行优化后，扩增效率能接近达到1，经过参照基因的标化，和校准品进行比较，靶基因的相对量为【9】公式显示。

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1.2. 2－△△CT方法的假设和应用
2^－△△CT方法能有效应用，前提是内参基因和靶基因的扩增效率要一致。
检验两个扩增子的扩增效率是否一致，可以将样品稀释成不同的浓度，分别进行实时PCR扩增，检测各稀释度样品的ΔCt值。如果所得直线斜率绝对值接近于0，说明内参基因和靶基因的扩增效率相同，就可以通过△△CT方法进行相对定量。

如图显示的是 cDNA 样品在 100 倍稀释范围内的实验结果。
对于每一个稀释样本，扩增GAPDH（内参分子） 和c-myc 基因（靶标分子）。根据c-myc 和 GAPDH 的Ct值计算△Ct值，通过cDNA 浓度梯度的log值对△CT值作图，图中直线斜率是0.047，说明假设成立，△△CT方法可以用来分析数据。
如果两个扩增反应效率不同，则需要通过定量标准曲线和绝对定量的方法来进行相对定量；
或者也可以重新设计引物，优化反应条件使得内参基因和靶基因具有相同的扩增效率。

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1.3   2－△△CT内参基因和参照品的选择
2－△△CT方法中，标准的看家基因一般都可被用作内参基因，比如GAPDH，β -actin，β2-microglobulin 以及rRNA 。在应用某一基因作为内参之前首先确定该基因的表达不会受实验处理的影响。
验证实验处理是否对内参基因表达产生影响的方法在2.2 部分有描述。

2－△△CT方法中参照品的选择根据实验目的和设计有关，最简单的设计就是把未经处理的样品作为参照品（calibrator ）。
经内参基因均一化处理后，通过方法计算，靶标基因表达差异通过经过处理的样本相对于未经处理的样本的倍数来表示。对于未经处理的参照品，△△CT=0，而2^0=1。所以根据定义，未处理样本的倍数变化为1 。而对于那些经过处理的样本，相对于参照品，基因表达的倍数为2^－△△CT。
同样的分析也可用于不同时相的基因表达差异，在这种情况下，一般选0 时刻的样本作为参照品。

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有些情况下，并不是比较不同处理样本之间的基因表达差异。比如，表1显示了大脑和肾脏总RNA 中c-myc 和GAPDH 转录本的CT 值。在这个例子中，大脑被选择为参照因子，经GAPDH 校正後，通过计算得到肾脏c-myc 表达量相对于大脑的表达量的结果。

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1.4. 2－△△CT方法的数据分析

此处以一个基因表达定量的实验数据为例，运用. 2－△△CT 方法进行数据分析。

靶标基因为fos-glo-myc，内参基因为β-actin，对靶基因8小时内表达量的变化进行实时监测，每一时间点取 3 个重复样本，Ct值为复孔平均值。

Time x 表示任意时间点，Time 0 表示经 β-actin 校正后，靶基因表达是 1 倍表达量的时间点。

通过验证在Time 0 时刻3个重复样品的靶基因表达量，能有效验证重复样品之间是否有错误或者误差。如果靶基因表达量和1相差比较大，则表明存在计算错误或者有很高的实验误差。