抗登革病毒2 型E 蛋白单克隆抗体的制备和生物学特性的鉴定

米小圈

抗登革病毒2 型E 蛋白单克隆抗体的制备和生物学特性的鉴定

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摘要:
目的：为制备可用于胶体金快速检测试纸条的抗登革病毒2 型( DEN2) E 蛋白单克隆抗体( mAb)
方法： 构建DEN2 E 基因与质粒pET32a( + ) 的重组质粒，表达重组蛋白。以DEN2 重组E 蛋白免疫BALB/ c 小鼠, 采用杂交瘤技术制备抗DEN2E 蛋白的mAb, 以间接ELISA 法和Western blot 进行mAb特异性鉴定; 同时采用间接ELISA 法鉴定mAb 的Ig 亚类。
结果：获得1 株可分泌特异性mAb 的杂交瘤细胞( 7C7) , 其抗体亚类为IgG1。Western blot 显示该株mAb 能特异识别重组pET32a-DEN2 E 蛋白。
结论：成功制备出抗DEN2 E 的1 株mAb, 为建立快速特异检测登革病毒感染的实验方法提供了有力的工具。

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背景资料：
登革病毒( Dengue virus, DEN) 感染主要引起登革热( DF) 、登革出血热( DHF) 和登革休克综合症( DSS) , 人群对登革病毒普遍易感。
目前对该病尚无疫苗预防和特效药物治疗, 加上控制蚊媒困难等原因, 登革病毒感染在世界范围内呈蔓延趋势。
快速方便的检测方法就势在必行。
登革病毒可编码3 种结构蛋白( 核心蛋白c、膜结合蛋白前体PrM和包膜蛋白E) 和7 种非结构蛋白( Ns) 。
包膜蛋白E 蛋白是DEN 吸附靶细胞、致病及诱导免疫保护的关键性蛋白, 是登革病毒重要的抗原蛋白, 也是登革病毒主要的毒力蛋白, 而且还带有型特异、属特异抗原决定簇。
利用重组E 蛋白来制备抗登革病毒2 型( DEN2) E 蛋白的单克隆抗体( mAb) , 为下一步制备E 蛋白的胶体金试纸条做准备。
（备注：目前已经有登革病毒的NS1蛋白的胶体金试纸条）

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材料试剂：
质粒pSV-ME，pET-32a
小鼠抗DEN2 血清
构建杂交瘤所用试剂：福氏佐剂, PEG(Mr4000) ,HAT, HRP 标记的羊抗鼠IgG 及鼠抗体IgG 亚类ELISA 试剂盒
Supersignal West Pico Chemiluminescent Substrate Kits（PIERCE 公司）

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M1: 5' -GCGAGATCTATGCGTTGCATAGGAAT-3'
M2: 5' -ATGCTCGAGAGTCCATGAGACCCCACTG-3'

PCR扩增得到1-1362nt的基因，插入到载体pET-32A中。
M1引物设计时如果能去除ATG更好。

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用小鼠抗DEN2 血清检测表达蛋白，

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杂交瘤细胞的建立
重组蛋白pET-32a-E 与福氏完全佐剂混合至完全乳化, 对BALB/c 小鼠腋下, 腹股沟及背部皮下多点注射, 剂量为每只100μg, 进行基础免疫。
每隔2 周以福氏不完全佐剂加100μg 重组蛋白溶液间加强免疫3 次。
末次免疫后2 周即在追加免疫前先用间接ELISA 测定免疫小鼠的血清抗体滴度, 当达到1∶5×10^5 后, 取相同的抗原量尾静脉注射追加免疫。

加强免疫后的第3d, 取免疫小鼠的脾细胞与Sp2 /0 小鼠骨髓瘤细胞融合, 用间接ELISA 法筛选能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞。筛选获得能分泌抗DEN2 E 的mAb 的细胞株共124 株。
通过有限稀释法克隆化使杂交瘤细胞100% 阳性, 经3 次克隆化培养, 逐级扩大培养冻存。间接ELISA 进行特异性筛选后得到了1 株可分泌抗DEN2 E 的特异性mAb 的细胞株( 7C7) 。
将杂交瘤细胞连续3 个月传代, 该细胞株仍能稳定分泌特异性的mAb。

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杂交瘤细胞的染色体计数
将杂交瘤细胞培养至对数生长期, 加入终浓度为0.08mg /L 的秋水仙素, 继续培养6h 后, 用0.075mol/L 的KC1 低渗处理30min, 甲醇: 冰醋酸为3∶1 的固定液固定3 次, 加入少量固定液混匀, 滴片, Gimsa 染色, 油镜下观察分析细胞分裂中期的染色体核型, 并进行显微摄像。

C7 细胞核型分析染色体数目接近2 种亲本细胞的染色体数目之和, 即小鼠脾细胞的染色体数目( 40条) 与Sp2 /O 骨髓瘤细胞染色体数目( 2n=54-64) 之和。7C7 株的染色体众数为99 条。显微镜下观察, 这株细胞的染色体核型主要为端着丝粒, 少数为中着丝粒。

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杂交瘤细胞培养上清Ig 亚类鉴定
用细胞上清与羊抗鼠Ig 及其亚类进行ELISA 间接反应, 结果显示mAb 属于IgG1 亚类。

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杂交瘤培养上清和腹水单抗的效价测定
腹水效价能达到10^-6