辅助噬菌体在噬菌体展示中的应用及研究进展

潇湘妃

辅助噬菌体在噬菌体展示中的应用及研究进展

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摘要:

噬菌体展示技术是一种将外源肽或蛋白质与特定噬菌体衣壳蛋白相融合，展示于噬菌体表面来构建蛋白质或多肽文库，并从中筛选目的蛋白、多肽或抗体的基因工程高新技术。

噬菌粒/辅助噬菌体系统是最常用的噬菌体展示系统，此系统中辅助噬菌体对噬菌粒的复制和组装发挥着至关重要的作用。

本文结合当今该领域的最新研究动态，概述了噬菌粒和辅助噬菌体双基因组系统，着重介绍了不同辅助噬菌体的特点及其突变机制，并对其应用前景进行了展望，以期为该技术的进一步完善提供一定的借鉴作用。

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近年来, 在肿瘤学、免疫学、蛋白质工程和配体、受体等研究领域中, 噬菌体展示技术(Phage Display Techniques, PDT)逐渐发展成为这些领域的主流技术。该技术的最大特点是将基因型和表现型直接偶联，确保方便，快速地获得所展示的目的蛋白和编码此蛋白的基因。

通常用于噬菌体展示的载体有两类：噬菌体载体和噬菌粒载体。

噬菌粒载体有基因组较小、易于操作、可插入的片段较大、转化效率高、产生的重组体更加稳定等优点,  目前最常用的就是噬菌粒载体。噬菌粒只含噬菌体的部分遗传信息, 因而建库与筛库都需要辅助噬菌体(helper phage)为宿主细胞的噬菌粒 DNA 提供复制和包装所需的蛋白酶和外壳蛋白。

辅助助噬菌体提供的复制和包装机制,  不仅对噬菌粒基因组起作用,  而且对辅助噬菌体自身的基因组也起作用。

筛选时那些含有辅助噬菌体基因组的重组噬菌体可能会非特异性结合到选择分子上，严重降低筛选效率，因此辅助噬菌体对噬菌粒文库的质量是非常重要的。

通过对辅助噬菌体的不断改进, 不仅可以有效地提高目的蛋白展示水平,  而且可使从噬菌粒文库中筛选特异性结合子变得更加容易可靠, 从而使噬菌体展示技术作为一种高通量的筛选技术也正变得日臻成熟和完善。

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M13噬菌体是一种丝状噬菌体，内有一个环状单链DNA，长6407个核苷酸，含DNA复制和噬菌体增殖所需的遗传信息。M13 DNA的复制起始位点定位在基因间隔区IG内。

M13 噬菌体只感染F+(含F质粒，能产生性菌毛)的大肠杆菌。感染宿主后通常不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂。但生长水平比未感染组低。

M13 噬菌体的基因组90% 以上的序列可编码蛋白质，共有 11 个编码基因，基因之间的间隔区多为几个碱基，较大的间隔位于基因Ⅷ 和基因 Ⅲ 以及基因 Ⅱ 和基因 Ⅳ 之间，其间有调节基因表达和 DNA 合成的元件。

M13 噬菌体编码 3 类蛋白质：

包括复制蛋白(基因 Ⅱ，Ⅴ 和 Ⅹ)，形态发生蛋白(基因Ⅰ，Ⅳ 和 Ⅺ)，结构蛋白(基因 Ⅲ 、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ 和 Ⅸ)。

成熟噬菌体颗粒由 11 个病毒蛋白中的 5 个组成，至少 4 个其他蛋白(如基因 Ⅰ 、Ⅳ 和 Ⅺ 蛋白，以及宿主的硫氧还蛋白(thioredoxin)对噬菌体颗粒的组装和分泌是必须的。

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噬菌粒和辅助噬菌体的双基因组系统
噬菌粒是一个集质粒和丝状噬菌体有利特征于一身的载体，具有ColE1复制起点及抗生素抗性选择标记，以及丝状噬菌体的间隔区（IG区）。虽然噬菌粒载体携带有M13噬菌体的IG区，能够合成单链DNA，但是缺乏M13噬菌体的功能基因，没有M13噬菌体的gII蛋白，所以不能独立合成单链DNA。因此在细菌中，没有辅助噬菌体的超感染，噬菌粒只能像质粒一样进行基因扩增；而有了辅助噬菌体的超感染，由辅助噬菌体提供的gII产物将启动噬菌粒的滚环复制，产生噬菌粒的单链拷贝，这些单链拷贝经切割后产生切口，环化，最后被装进完整的子代噬菌体颗粒中。
衣壳蛋白
丝状噬菌体有pⅢ、pⅧ、pⅥ、pⅨ五种衣壳蛋白，这五种蛋白都可以用来进行多肽的展示，但最常用的是pⅢ和pⅧ蛋白。

基因间隔区（IG region）
基因间隔是DNA 的一个片段，不属于编码区。在噬菌粒进入宿主细胞质后，IG 区的单链DNA 复制起始位点（噬菌体ori 区域）会被PⅡ蛋白识别进而引发单链DNA 的生成。

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噬菌粒生命周期

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辅助噬菌体
辅助噬菌体是一种自身DNA 复制效率极低的丝状噬菌体突变型。其基因组具有M13 噬菌体的所有功能基因，但IG 区是缺陷的，不能被pⅡ蛋白识别，因而辅助噬菌体本身DNA 不能进行单链复制。同时因为IG区的失活，使得其本身基因不能表达。为使辅助噬菌体的所有功能基因都能表达，必须在辅助噬菌体的基因组中导入新的复制起点。辅助噬菌体能为噬菌粒提供pⅡ蛋白和包装蛋白，在辅助噬菌体的帮助下，噬菌粒可以顺利的进行DNA 的复制与噬菌体的包装，完成对宿主的侵染（这一过程通常称为超染）。常用的辅助噬菌体有VCSM13 和M13K07 等。
辅助噬菌体的工作原理为：当含有重组基因的噬菌粒转染至大肠杆菌后，再用辅助噬菌体进行超染，辅助噬菌体合成的pⅡ蛋白就会优先识别噬菌粒上的正常基因间隔区（IG region）,启动滚环复制，产生ssDNA，这样所产生的子代噬菌体外壳蛋白所包装的ssDNA 主要是来自含有重组基因组的噬菌粒的DNA，并同时展示噬菌粒编码的pⅢ或pⅧ与外源肽段的融合蛋白和辅助噬菌体编码的野生型pⅢ或pⅧ蛋白，确保重组噬菌体能正常感染组装和增殖。

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辅助噬菌体主要有两大类：
1 含全长gIII的辅助噬菌体
2 gIII删除或者gIII缺陷的辅助噬菌体。

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含全长gIII 的辅助噬菌体

含全长gIII的辅助噬菌体主要包括M13KO7，R408和VCSM13，它们是目前最为广泛使用的辅助噬菌体。
辅助噬菌体MI3KO7是M13噬菌体的一个突变体，带有一个质粒复制起点、卡那霉素抗性基因以及G6125T的突变基因II。

当M13KO7超感染含抗有噬菌粒的菌株时，M13KO7突变的gll产物将优先可作用于噬菌粒载体上的复制起始区，使得噬菌粒产生的(+)链多于铺助噬菌体产生的(+)链，因而保证噬了感染细胞产生的病毒颗粒中来源于噬菌粒的单链它DNA占优势。
当M13KO7生长在没有噬菌粒载体本的的条件下时，突变gIl的产物又能与其被损坏的复菌制起始区作用，产生足量的噬菌体，用于超感染。

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R408是f1噬菌体的一个突变体，删除了其IG中的24bp的区段，从而使其包装带有完整信号的单链DNA优于其自身单链DNA。另外，它还带有一个称为IRI的突变，使得它对缺陷病毒的干扰不敏感。
与MI3KO7不同的是，R408不带抗生素抗性标记基因。用辅助噬菌体R408超感染含有 pEMBL19的菌株HB101，结果可以大大提高单链质粒DNA的产量。

这些含全长gII基因的辅助噬菌体进行超感染的优点是:
产生的辅助噬菌体和重组噬菌粒颗粒的滴度均较高；单价展示所产生的目的蛋白的特异性强。

其缺点是:
1. 虽然这些辅助噬菌体基因组不具有包装信号，但是超感染后所产生的辅助噬菌体的数目有时与噬菌粒颗粒的数目相同，有时甚至超过菌粒颗粒的数目，这种表现型和基因型的不一致严重降低了筛选效率;
2. 由噬菌粒编码的融合蛋白同辅助噬菌体编码的野生型pIII相比，在噬菌体组装时噬菌粒编码的融合蛋白嵌入噬菌体的效率低，因此展示水平较低。

展示水平和筛选效率的降低，很有可能共同导致分离特异性结合子阳性克隆的失败。