Assembly of combinatorial antibody libraries on phage surfaces

傲慢与偏见

Assembly of combinatorial antibody libraries on phage surfaces: The gene III site
pCOMB3系列载体都是来源于这篇文章。

傲慢与偏见

本文讲述了pCOMB3载体的构建过程，Fab抗体和PIII蛋白融合，呈现出噬菌体表面。
pCOMB3载体目前主要用于抗体库的构建，通过将轻重链片段顺次连接进入载体，保证了抗体基因的多样性。早期噬菌体展示系统用λ噬菌体，但是库容量不够高，所以优化后改为丝状噬菌体。

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载体构建：
包含pelB信号肽和轻链重链区的插入位点的区域来自噬菌粒λHc2以及λLc2。
去除了原片段上的Sac I和Spe I，轻重链之间的连接序列为GGGGS。
gIII蛋白来自噬菌体M13m18扩增产物，1300bp左右。控制轻链表达的Lac Z启动子，操纵子和CAP结合位点序列来自M13M18扩增产物。
构建了一个AMP抗性的质粒pCOMB3
同时，也构建一个氯霉素抗性的质粒pCBCOMB3。


载体中Xho I和Spe I酶切位点用于Fd段的插入，Sac I和Xba I酶切位点用于轻链的插入。人源抗体和鼠源抗体均可使用该载体。Spe I和Nhe I为同裂酶，双切后进行连接去掉了663bp的GIII基因片段，形成可溶性的Fab蛋白。

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丝状噬菌体是一类单链环状细菌DNA病毒，如M13，fl，fd等，其通过基因Ⅲ蛋白产物吸附雄性大肠杆菌的性纤毛而感染宿主细菌。
基因III蛋白的一段406个aa的短蛋白，分子量约为42.5kda。
和基因VIII蛋白一样，首先合成前体蛋白，在剪掉信号肽后，锚定在质膜上。噬菌体的装配过程发生在质膜上，在组装释放之前，蛋白停留在质膜上。
PIII蛋白分N端和C端两部分，其中N端又分为N1区和N2区，这两个区域和噬菌体的感染性有关，在噬菌体感染细菌时，PIII作为吸附蛋白可以吸附到宿主菌的纤毛上，开启噬菌体感染细菌的过程；C端维持噬菌体粒子的稳定性。

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当外源的多肽或蛋白融合于PⅢ蛋白的信号肽和N1之间时，该系统保留了完整的PIII蛋白，噬菌体仍然具有感染性。
在外源多肽或蛋白直接与PⅢ蛋白的C末端结构相连，则噬菌体会丧失感染性，这时重组噬菌体的感染性由辅助噬菌体表达完整PⅢ蛋白来提供。
pComb3 载体设计为Fd段和cpIII蛋白羧基端（P198-S406)进行融合。载体上在Fd段和cPIII蛋白之间插入一个不会形成二级结构的GGGGS序列，以减小Fd段和cPIII蛋白之间的相互作用。Fd-cpIII融合蛋白和轻链蛋白分别受两个lac启动子/操纵子的控制，翻译出的蛋白质分别通过pelB先导序列进入细胞膜间隙，重链Fd通过与pIII融合镶嵌在膜上，而轻链则独自分泌入膜间隙，重链和轻链在膜上组装成有活性的Fab抗体。
载体上包含噬菌体F1的基因间隔序列，在辅助噬菌体的作用下，能包装单链噬菌粒形成噬菌体颗粒。
噬菌体颗粒的顶端形成两种cpIII外壳蛋白，一种是带有Fab抗体的融合蛋白形成，另一种是天然的外壳蛋白cpIII。

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丝状噬菌体是一种能够感染阴性细菌的细菌病毒，含有单链DNA基因组，它的衣壳蛋白是管状，通常由几千个拷贝的主要衣壳蛋白（PVIII）和位于尾端的次要衣壳蛋白（PIII）组成。每个病毒颗粒具有3-5个拷贝的PIII蛋白，位于噬菌体的尾端，是噬菌体感染细菌所必须的蛋白。

PIII蛋白结构上分为N1,N2和CT三个功能区域。

其中N1作用于E.coli细胞膜上的Tol A蛋白，和噬菌体入侵有关。

N2是受体结合去，负责结合F菌毛。

CT区在组装前黏附在细菌内膜上，与噬菌体组装终止有关。

PIII有2个位点可以供外源基因的插入。

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电镜观察
电镜下观察人源性抗破伤风Fab小分子抗体在噬菌体的展示。
(A) 噬菌体尾部可见展示出来的由pComb 3噬菌粒介导的破伤风Fab小分子抗体，噬菌体可见5-7nm包裹有破伤风毒素的胶体金标记(x140,000)

(B) 和之前gVIII 多价展示系统一致，丝状噬菌体的菌体显示有特异性标记。(x65,000)

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噬菌体制备和扩增：
噬菌粒载体转化XL1-Blue，37℃，在SB培养基中进行放大培养。
SB培养基：1L水中溶解30 g胰蛋白胨，20 g酵母提取物，10 g MOPS, pH 7
在培养基中加入相应的抗生素，四环素终浓度10ug/ml，青霉素终浓度为50 ug/ml，氯霉素终浓度为30 ug/ml。
细菌培养到OD=0.4左右，感染VCSM13辅助噬菌体(MOI=20), 低速培养1个小时，加入终浓度为70 ug/ml的卡那霉素，200rpm，过夜培养。
PEG/NaCl沉降，PBS重悬噬菌体，-20° C保存。

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固相筛选
Costar 3690板每孔包被25ul的破伤风毒素，4°C 包被过夜。
37℃，5%脱脂奶封闭1小时。每孔加入10^11 cfu的噬菌体，37℃孵育2小时。
水洗一次，TBS/Tween solution (50 mM Tris HCl, pH 7.5/150 mM NaCl/0.05% Tween 20) 清洗10次。
用50ul洗脱液(0.1 M HCl溶解的1 mg/ml甘氨酸, pH 2.2)  洗脱和破伤风毒素结合的噬菌体，常温下孵育10分钟，收集洗脱液。
根据投入和产出的噬菌体量，计算投入产出比。