Human Neutralizing Fab Molecules against Severe Acute ......

傲慢与偏见

荧光定量RT-PCR检测M1A的中和活性
用SARS-CoV RNA (0.1, 1, 10, 100, 1,000, 10,000 PFU) 进行RT-PCR描制标准曲线，CT值和病毒拷贝数呈现正相关关系。
病毒感染后的第1-6天，提取实验组 (加0.5 mg/ml M1A和病毒) 和对照组（只加病毒）的总RNA，用冠状病毒荧光定量PCR检测试剂盒进行检测，反应条件为：
RT：42°C，30 min；95°C，3 min,
PCR：95°C 10 s, 55°C 30 s, 72°C 60 s，40个循环； 95°C 5s，60℃，30s。

实验组和对照组比较，拷贝数降低约20倍，证实了M1A的中和活性能力。

傲慢与偏见

讨论
SARS病毒 Beijing 01株作为抗原用于淘选，
SARS-CoV病毒的中和抗原表位主要集中在S蛋白，和病毒结构蛋白相比，S蛋白非常小，得到中和抗体比较困难。
恢复期患者血液中保护性抗体，ELISA检测滴度大于1：264，MNT检测大于1：64，由此构建Fab抗体库。
淘选第一轮，第二轮用纯化的病毒颗粒作为抗原。
第三轮，第四轮用重组的刺突蛋白作为抗原进行筛选。
最终筛选到一株FAB抗体M1A，ELISA检测和S蛋白特异性结合，中和实验显示0.25 mg/ml的M1A能延迟病毒感染细胞后的CPE反应。
M1A的终点滴度达到0.5mg/ml时，能完全中和SARS-CoV。MNT实验不能精确计算M1A的IC50，只能估计约为0.25-0.5mg/ml。

傲慢与偏见

荧光定量RT-PCR用于测试实验组 (加0.5 mg/ml M1A和病毒) 和对照组（只加病毒）病毒感染细胞后每日（D1-D5)的病毒拷贝数，显示M1A处理组的病毒拷贝数比对照组降低20倍左右。
体外实验证实M1A展示对SARS-CoV病毒有中和活性，有发展为治疗性抗体的可能性。之前研究表明和全抗相比较，Fab分子缺乏Fc片段亲和力会降低100倍左右，对Fab抗体进行结构改造能够提高抗体亲和力和中和活性，因此可以对M1A进行进一步的改造，以期用于针对SARS-CoV病毒的被动免疫。