Noncytopathic Flavivirus Replicon RNA-Based System for Expression and Delivery

潇湘妃

Noncytopathic Flavivirus Replicon RNA-Based System for Expression and Delivery of Heterologous Genes

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摘要笔记：
kunjin无细胞毒性的复制子载体可以用来表达和递送外源基因。
构建复制子载体C20DX2Arep, 以及一系列包含报告基因CAT，GFP，β-gal，外源基因水疱性口膜炎病毒糖蛋白G，丙肝病毒C和NS3蛋白的复制子载体。
转染BHK-21细胞后，通过IFA，免疫沉降，报告基因检测等实验验证了外源基因的表达和正确加工。
进一步转染表达KUNJIN结构蛋白的SFV复制子载体，有些WNV复制子能成功包装获得假病毒颗粒。
用这些病毒颗粒持续感染BHK-21和Vero细胞，可以观察到外源基因能持续表达，并且对细胞无毒性。
同时构建了We also developed a replicon
vector for generation of stable cell lines continuously expressing heterologous genes by inserting an encephalomyelocarditis
virus internal ribosomal entry site-neomycin transferase gene cassette into the 39-untranslated region of the C20DX2Arep
vector. Using this vector (C20DX2ArepNeo), stable BHK cell lines persistently expressing GFP and CAT genes for up to 17
passages were established. Thus noncytopathic KUN replicon vectors with the ability to be packaged into VLPs should
provide a useful tool for the development of noninfectious and noncytopathic vaccines as well as for gene therapy
applications. ©

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实验所用主要材料：
BHK-21细胞，Vero细胞。
构建一系列的复制子质粒
① C20DX2Arep和C20DX2ArepNeo：在原有复制子载体C20DXrep的基础上添加了长为19个氨基酸的FMDV 2A序列，该序列的添加可以确保外源基因在胞内表达后的正确切割，前面是保留了20个氨基酸序列的C蛋白，后面是E蛋白的末端22个氨基酸序列。
② C20DX/CAT/2Arep和C20DX/CAT/2ArepNeo
③ C20DXIRESrep和C20DX/CAT/IRESrep，在外源基因后加终止密码子，在终止密码子后插入IRES序列，是一个双顺反子载体。
④ 插入各种报告基因的复制子载体，C20DX/GFP/2Arep, C20DX/GFP/2ArepNeo, C20DX/hcv-trCore/2Arep, C20DX/hcv-flCore/2Arep, C20DX/hcvNS3/2Arep, C20DX/VSV-G/2Arep和C20DX/b-gal/2Arep

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FMDV 2A序列：
NFDLLKLAGDVESNPGP
是自剪切多肽的典型代表，识别位点在NPG/P位置，是构建单个载体表达多蛋白的一个重要工具。