Construction of a Multipurpose M13KE Phage Display System

真核表达 · 发表于 2020-6-9 08:44:38

本帖最后由真核表达于 2020-6-9 21:57 编辑

Construction of a Multipurpose M13KE Phage Display System

真核表达 · 发表于 2020-6-9 09:12:36

材料和方法
Acquisition of tglll by PCR
Construction of M13KE-tgIII vector
Cloning of tag proteins HA and c-Myc
SDS-PAGE analysis of M13KE phage proteins
Western blot analysis of phage proteins

真核表达 · 发表于 2020-6-9 09:30:01

结果：
Full-length sequence assembly of tgIII gene。
Construction of M13KE-tgIII vector
Phage proteins isolated from M13KE-tgIII vector
Construction of M13KE-HA-tgIII-myc vector and analysis of tag protein expression.

真核表达 · 发表于 2020-6-9 09:41:26

以M13KE噬菌体为起始载体，建立一种无需辅助噬菌体的较长片段多肽库展示系统，以解决当前噬菌体展示仅能筛选短肽库现象，扩大靶向高通量筛选范畴。

真核表达 · 发表于 2020-6-9 10:20:03

本帖最后由真核表达于 2020-6-11 08:06 编辑

通过两步PCR得到野生型gIII的启动子和信号肽的基因序列：GCCGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTGTGAAAAAATTATTATTCGCAATTCCTTTAGTGGTACCTTTCTATTCTCACTCGCCGCGGTCCTGATTTCGGACTCGTGGTGGCTCTGGTT
红色标记为Bts I酶切位点。

真核表达 · 发表于 2020-6-11 09:01:27

本帖最后由真核表达于 2020-6-11 20:21 编辑

通过融合PCR得到的序列

GCCGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTGTGAAAAAATTATTATTCGCAATTCCTTTAGTGGTACCTTTCTATTCTCACTCGCCGCGGTCCTGATTTCGGACTCGTGGTGGCTCTGGTTCCGGTGATTTTGATTATGAAAAGATGGCAAACGCTAATAAGGGGGCTATGACCGAAAATGCCGATGAAAACGCGCTACAGTCTGACGCTAAAGGCAAACTTGATTCTGTCGCTACTGATTACGGTGCTGCTATCGATGGTTTCATTGGTGACGTTTCCGGCCTTGCTAATGGTAATGGTGCTACTGGTGATTTTGCTGGCTCTAATTCCCAAATGGCTCAAGTCGGTGACGGTGATAATTCACCTTTAATGAATAATTTCCGTCAATATTTACCTTCCCTCCCTCAATCGGTTGAATGTCGCCCTTTTGTCTTTGGCGCTGGTAAACCATATGAATTTTCTATTGATTGTGACAAAATAAACTTATTCCGTGGTGTCTTTGCGTTTCTTTTATATGTTGCCACCTTTATGTATGTATTTTCTACGTTTGCTAACATACTGCGTAATAAGGAGTCTTAATAAGCAGTGCGCGAATTCCGGC

红色标记为Bts I酶切位点。

将这一段序列用Bts I酶切后，插入M13KE中，构建M13KE-TGIII
但是有一个问题是，M13KE中只有一个Bts I酶切位点，并且不在GIII区，不知道这个载体是怎么构建出来的。

真核表达 · 发表于 2020-6-11 22:15:56

标签蛋白HA和c-myc的插入
按照文献描述
HA序列通过两段核苷酸退火后通过Sac II和Spe I插入
但是根据文章中给出的两段序列，构建出的一个linker，两端是Eag I酶切位点残基，并不是Sac II和Spe I！

GGCCGAATACCCATACGACGTTCCAGACTACGCTTC

CTTATGGGTATGCTGCAAGGTCTGATGCGAAGCCGG

c-myc序列退火后构建的linker，两端是Eag I酶切位点残基

GGCCGAACAGAAGCTGATCTCTGAAGAAGACCTGTC

CTTGTCTTCGACTAGAGACTTCTTCTGGACAGCCGG

M13KE上只有一个Eag I酶切位点，理论上是不太可能构建出这个质粒M13KE-HA-Myc

真核表达 · 发表于 2020-6-11 22:23:09

这篇文章和英文版的一致，实验数据一样，本来是想参考他们的数据插入长肽序列，但是根据这些发布的引物序列，很难搞清楚这个载体到底怎么构建出来的

phoenix_eagle · 发表于 2023-2-23 14:20:31

看不懂，为啥要做成图片，还要加上Logo，感觉很高大上的亚子。

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