Encapsidation of the Flavivirus Kunjin Replicon RNA by Using a Complementation

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Encapsidation of the Flavivirus Kunjin Replicon RNA by Using a Complementation System Providing Kunjin Virus Structural Proteins in trans

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文章构架：
Construction of the plasmidsRNA transcription and transfection
Metabolic labeling and RIP analysis
Northern blot hybridization
Preparation of encapsidated particles and determination of their titer

结果部分：
Expression of the KUN C gene by the recombinant SFVC107 replicon
Expression of KUN prME genes by the recombinant SFVprME replicon
Expression of all three KUN structural proteins by the recombinant SFV-prME-C107 replicon.
Packaging of the KUN replicon RNA into pseudoinfectious particles by the KUN structural proteins expressed from the recombinant SFV replicons
Characterization of the infectious particles

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文章摘要：待整理
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背景资料：
待整理 待整理

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本研究中涉及到的质粒载体
(i) C20DXrep。
和原来的C20rep设计一致，去除C157-E2403一共2247nt。
和C20rep区别在于两个载体分别是在两个不同的感染性克隆质粒基础上构建而得，新构建的感染性克隆FLSDX比原来构建的感染性克隆pAKUN，感染能力增强100,000倍。
(ii) SFV-C107. 一个表达KUN C蛋白的SFV复制子载体。含有C基因的前107位，如图，切割后的成熟C蛋白为105位氨基酸，这个复制子多了GGIPGN6个氨基酸。(iii) SFV-prME.一个表达KUN prME序列的SFV复制子载体，包含prM和E基因。
(iv) SFV-prME-C107，通过两个亚基因复制子分别表达prME和C107基因。
SFV载体对细胞无毒性，能高表达异源蛋白，本研究用于表达KUN结构蛋白，包装病毒颗粒。
最开始用SFV载体pSFV1表达C-prM-E全长基因，但是质粒不好构建，因此改为两段基因分别表达C和prM-E基因。

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电转RNA
KUN复制子载体/结构蛋白表达载体在体外都能转录为RNA形式。
首先验证几个质粒在细胞中的表达情况SFV-C107能在100%的细胞中表达，如图:

A中1，3，5为BHK-21细胞在转染SFV-C107 RNA后18小时的IFA实验结果，1为低倍镜，3，5放大倍数加大，可以看到C蛋白在胞浆（丙酮固定），以及胞核（用甲醛+甲醇固定）均有表达
2，4，6为空载体转染后的细胞。

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RIP实验结果

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SFV-prME RNA转染BHK-21细胞后鉴定prM-E蛋白：
黄热病毒prM-E蛋白一般用重组痘病毒或者DNA表达载体，SIN复制子载体进行表达
可以产生加工正常的prM-E蛋白亚病毒颗粒。
为确保表达的prM-E蛋白能正确加工和分泌为亚病毒颗粒，prM基因和E基因都需要保留全长，包括亲脂区序列，如信号肽和锚定序列等。SFV-prME RNA电转BHK-21细胞，18小时后用抗-E单抗进行检测，阳性率为100%。

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鉴定SFV-prME-C107转染BHK-21细胞后能表达3个结构蛋白
prM-E和C基因分开表达，能和KUN复制子包装成假病毒颗粒，但是包装效率非常低。
因此构建一个能同时表达3个蛋白的SFV载体，prM-E和C基因分别由两个26S启动子控制。
转染18小时后，IF检测100%细胞表达E蛋白和C蛋白。

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