0008 GST PULL DOWN assay

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被捕获蛋白B的特性：
目前，GST pull-down 技术主要的应用是体外验证两种蛋白（诱饵蛋白--靶标蛋白）之间是否存在直接的相互作用，用途主要有两个方面：
① 证实两种已知蛋白之间可能存在的相互作用；
② 寻找能与已知蛋白发生相互作用的未知蛋白。
已知蛋白可以通过重组蛋白的形式表达纯化，被探针蛋白pull down后，通过WB鉴定捕获蛋白。而未知蛋白需要通过提取特定细胞或组织的总蛋白来实现，受表达量较少的限制，可选择放射性标记蛋白，进行放射自显影，以确保检测的灵敏性。

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三、体外A-B蛋白的结合
① 取已经处理好的GST-A-珠子10ul（约含目的蛋白10-20ug）至1.5ml离心管，加入10ul的预处理的蛋白B液，补结合缓冲液至500ul，同时设置GST标签蛋白-珠子作为阴性对照；
② 4℃翻转混合，孵育至少4h，（时间可适当延长，如过夜以让其充分结合）；
③  用1ml预冷含1％ Triton-X-100的PBS洗珠子3次，PBS洗珠子3次，每次加入液体后充分混匀，4℃，500g离心5min，弃上清（注意不要搅动底层的珠子），最后一次留下和珠子等体积的PBS，重悬珠子；
④ 取样品50ul，加入蛋白上样缓冲液。轻弹混匀，沸水煮5~10min，离心后收集上清；
⑤ SDS-PAGE后进行放射自显影或者Western Blot检测。

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GST pull-down结果分析：
以一篇NATURE文章的Pull-down结果为例进行数据分析：

   

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这篇文章进行的pull-down实验是检测蛋白USP21和Nanog之间的直接相互关系。
诱饵蛋白是USP21，靶标蛋白是Nanog。
实验分了两组：GST 组及GST-USP21组，分别去拉（pull down）目标蛋白HIS-Nanog。
首先看最下端的WCE细胞裂解物，可以看到两组的Nanog蛋白都能检测出来，说明要进行pull-down的两组input体系没有问题。
进行pull-down实验后，可以看到右侧GST-USP21组能Nanog蛋白拉下来，所以WB能检测到相应条带，而GST组没有将Nanog蛋白拉下来，WB检测不到Nanog蛋白，从而证明了USP21和Nanog之间存在直接的相互关系。

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GST pulldown方法的衍生
目前已经有很多商品化的试剂盒，不过价格比较昂贵，GST pull-down技术操作起来不难，按照上述protocol，多摸索几次，一定能做出满意的结果。GST pull-down实验主要用来证实蛋白质的胞外相互作用，采用固相化的GST融合蛋白作为诱饵蛋白。除了GST标签外，也可以用HIS标签，生物素标签等等，不同的标签选择各自相应的固相载体进行固相化连接即可。如：

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该文中用pull-down实验验证p38α 和丙型肝炎核心蛋白之间的结合，用带有HIS标签的p38α作为诱饵蛋白，结合NI-NTA珠，捕获了GST-HCV C融合蛋白。
图5C：右侧一组可见固化在NI-NTA珠子上的HIS-p38α能成功地将GST-HCV-core拉下来，WB能检测到pull-down之后GST-HCV-core的存在。左侧一组可见固化在NI-NTA珠子上的HIS-p38α和对照蛋白GST结合，不能将GST拉下来，pull-down后检测不到GST蛋白。不过有一点疑惑的是，第四行INPUT中检测GST/GST-HCV core蛋白，两个蛋白不一样大小，为什么会在同样大小的位置出现？可能不是一张膜做的WB？或者对照不是单一的GST蛋白？
图7G：检测P38抑制剂SB203580对P38和HCV core蛋白之间相互租用的影响，左侧一组未加抑制剂，右侧加抑制剂，结果清晰明了。

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GST pull-down实验的局限性
① 验证蛋白之间的相互作用是在试管中进行的生化反应，不能够完全反应细胞内蛋白真实互作状态；
② 融合表达的GST标签，肽链较长，可能会改变目的蛋白原有的折叠结构，干扰实验结果，造成假阳性/假阴性。
③ 高浓度的GST融合蛋白本身具有自发荧光，因此实验中尽量用低剂量的GST融合蛋白，避免GST自发荧光的干扰。

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GST pull-down实验

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