人源化Fab段噬茵体抗体库的构建及初步鉴定

潇湘妃

人源化Fab段噬茵体抗体库的构建及初步鉴定

潇湘妃

摘要
目的：构建人天然Fab段噬菌体抗体库，为人源抗体的制备建立技术平台。
方法：从正常健康人的外周血淋巴细胞中提取总RNA，用RT-PCR方法扩增人抗体轻链和重链Fd段基因，构建噬菌体抗体库，酶切鉴定有无插入片段并测序分析，用IL-2和地高辛进行富集筛选。
结果：最终构建的抗体库库容约为8.4×10的7次方，酶切鉴定显示有插入片段，抗体库重组率是70％，DNA测序分析证实抗体重链属IgG亚类，轻链为λ链。用IL-2和地高辛进行三轮筛选，抗体库均得到了不同程度的富集。
结论：成功构建了一个天然的人源化噬菌体抗体库，可用于下一步胰淀素人源化抗体的筛选、纯化和表达。

目前抗体库的种类主要有以下几种类型，本研究中构建的抗体库更像是全人源的，而非人源化抗体。

潇湘妃

实验材料：
大肠杆菌XLl一Blue，辅助噬菌体VCSMl3，噬菌粒载体pComb3XSS
血液来自30名正常健康人。分离外周血淋巴细胞，提取细胞总RNA。以Oligo(dT15)为引物，RNA为模板逆转录合成eDNA第一链。
然后参照文献设计的引物，分别扩增轻重链。

(1)重链可变区5’端引物：(Xho I：CTCGAG）

VHla：5'-CAGGTGCAGCTCGAGCAGTCTGGG-3’

VHlf：5'-CAGGTGCAGCTGCTCGAGTCTGGG-3’

VH2f：5'-CAGGTGCAGCTACTCGAGTCGGG-3’

VH3a：5'-CAGGTGCAGCTCGAGGAGTCTGGG-3’

VH3f：5'-GAGGTGCAGCTGCTCGAGTCTGGG-3’

VH4f：5'-CAGGTGCAGCTGCTCGAGTCGGG-3’

VH6a：5'-CAGGTACAGCTCGAGCAGTCAGG-3’

VH6f：5'-CAGGTGCAGCTACTCGAGTGGGG-3’

(2)重链恒定区3’端引物（Spe I ：ACTAGT)：

CG1z：5'-GCATGTACTAGTTTTGTCACAAGATTTGGG-3’

CG2a：5'-CTCGACACTAGTTTTGCGCTCAACTGTCTT-3’

CG3a：5'-TGTGTGACTAGTGTCACCAAGTGGGGTTTT-3’

CG4a：5'-GCATGAACTAGTTGGGGGACCATATTTGGA-3’

潇湘妃

(3)K轻链可变区5’端引物：

Vk1a：5'-GACATCGAGCTCACCCAGTCTCCA-3’

Vk1s：5'-GACATCGAGCTCACCCAGTCTCC-3’

Vk2a：5'-GATATTGAGCTCACTCAGTCTCCA-3’

Vk3a：5'-GAAATTGAGCTCACGCAGTCTCCA-3’

Vk3b：5'-GAAATTGAGCTCACGCAGTCTCCA-3’

文中Vk3a和Vk3b序列一模一样，查引用的参考文献，原文的Vk3b在蓝色加粗处G应该是兼并碱基G/A。

(4)K轻链恒定区3’端引物：

Ck1d：5'-GCGCCGTCTAGAATTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTGACGGGCGAACTCAG-3’

潇湘妃

(5)λ轻链可变区5’端引物：

VL1：5'-AATTTTGAGCTCACTCAGCCCCAC-3’

VL2: 5'-TCTGCCGAGCTCCAGCCTGCCTCCGTG-3’

VL3：5'-TCTGTGGAGCTCCAGCCGCCCTCAGTG-3’

VL4: 5'-TCTGAAGAGCTCCAGGACCCTGTTGTGTCTGTG-3’

VL5：5'-CAGTCTGAGCTCACGCAGCCGCCC-3’

VL6：5'-CAGACTGAGCTCACTCAGGAGCCC-3’

VL7：5'-CAGGTTGAGCTCACTCAACCGCCC-3’

VL8：5'-CAGGCTGAGCTCACTCAGCCGTCTTCC-3’

(6)λ轻链恒定区3’端引物：

Cλ2：5'-CGCCGTCTAGAATTATGAACATTCTGTAGG-3’

潇湘妃

K链和入链PCR产物通过Sac I和Xba I连接到噬菌粒载体pComb3XSS，构建轻链库。
随机挑取10个菌落对轻链库进行Sac I和Xba I双酶切鉴定，轻链库的重组率为100％。

重链Fd段PCR产物通过Xho I和Spe I插入到轻链库噬粒中，库容为8．4 X 10的7次方。
随机挑取10个克隆进行酶切鉴定，重组率为70％。

可以随机选取阳性克隆的菌株进行测序，测序结果与GeneBank已知DNA序列进行同源性比对，分析轻链和重链的属性和同源性。

潇湘妃

噬菌体抗体库的质量主要包括抗体库的容量及其多样性。
抗体库容量越大，筛选到特异性抗体的几率就越大，其亲和力也越高。
抗体库的多样性越好，越容易获得高亲和力抗体。
为构建多样性好的抗体库，本文从30名正常健康人的外周血淋巴细胞中提取总RNA，经40对引物（应该45对？重链8*4对，轻链5*1对加8*1对）RT-PCR扩增出Fab抗体基因片段，采用转化效率高的电转化法进行多次转化以累积库容，最终构建了约8.4×10^7的天然人源Fab抗体库，重组率达到了70％。

潇湘妃

将IL-2和地高辛分别稀释至浓度为50 ug／ml包被酶联板，作为抗原对噬菌体抗体库进行了3轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选，第3轮比第1轮分别增加48倍和38倍，说明特异性噬菌体抗体得到了富集。

为下一步筛选Amylin胰淀素抗体做准备。

Cheny1024

潇湘妃 发表于 2019-5-19 10:28
K链和入链PCR产物通过Sac I和Xba I连接到噬菌粒载体pComb3XSS，构建轻链库。
随机挑取10个菌落对轻链库进 ...

楼主，噬菌粒上没找到XhoⅠ酶切位点

黄帮主

3XSS上有Xho I酶切位点。