一种高效、稳定的可溶性原核表达载体的构建及应用

大红袍

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摘要

目的：探究在原核表达载体pET-30a(+)载体中加入蛋白信号肽PelB序列和下游目标蛋白融合后能否实现可溶性表达。

方法：将上游带有PelB 信号肽编码序列的O 型口蹄疫病毒结构蛋白VP1编码区，以及VP1 C 端编码区,克隆至表达载体pET-30a(+)中,构建原核表达载体pET-30a-PelB2-VP1和pET-30a-PelB2-VP1C。分别转化大肠杆菌工程菌株BL21(DE3)plysS,进行表达纯化。

结果：金属离子螯合层析法纯化得到VP1及其C 端融合蛋白，具有较高的纯度。Western blot 分析两个蛋白均可与牛O 型口蹄疫病毒阳性血清反应。

结论：两种改构后的原核表达载体实现了蛋白可溶性表达。

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背景资料：

寻找一种稳定的可溶性蛋白表达系统，是发酵工程亟待解决的问题。

利用PelB、OmpA、OmpC、OmpT、OmpF、St Ⅱ、PhoA、LamB、LTB 等诸多蛋白信号肽，可以成功实现了下游融合蛋白的可溶性表达。

PelB(Pectate lyase B)是存在于纹枯病菌和胡萝卜软腐欧文氏菌中的一种果胶裂解酶，可作用于聚半乳糖醛酸的α-1 ，4-糖苷键使其水解。

PelB 蛋白前体含374个氨基酸残基，其中前22个氨基酸残基为其信号肽。和目的基因融合表达可以实现蛋白的可溶性表达。

这一段PelB信号肽核苷酸序列为(长69bp）：

AAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCTGCCCAACCAGCGATGGCCATGGAT

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主要实验材料

质粒pET-30a（+），原核表达载体。

大肠杆菌BL21(DE3)2plysS。

牛O 型FMDV 阳性及阴性血清

Invitrogen 公司的蛋白纯化试剂盒ProBond Purification System

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构建两个原核表达载体pET-30a-PelB2-VP1和pET-30a-PelB2-VP1C

第一步：

PCR扩增VP1基因以及VP1C基因，根据文中提供的引物序列，得到两个片段，分别为：

CGCGGATCC-638bp的VP1基因-CTCGAGCGG

以及

CGCGGATCC-374bp的VP1C端基因-CTCGAGCGG

第二步：

两步PCR法再将蛋白信号肽PelB序列和VP1 C端基因进行融合，可以得到

TATACATATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCTGCCCAACCAGCGATGGCCATGGGATCC-374bp的VP1C端基因-CTCGAGCGG

NdeI：CATATG /BamH I:GGATCC/ Xho I:CTCGAG

Xho I/Nde I双酶切处理载体pET-30a和融合后PCR产物，连接，转化，挑克隆，鉴定，测序。得到质粒pET-30a-PelB-VP1C质粒。

进一步通过Xho I/BamH I双酶切，处理载体pET-30a-PelB-VP1C和VP1的PCR产物，构建pET-30a-PelB-VP1质粒。

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pET-30a载体有两个HIS标签，分别位于读码框的两端，NOVAGEN官网上该质粒的细节图。

这篇文章中在引物pelb2扩（+）设计时，选择了Nde I酶切位点，在构建两个原核表达质粒时，原载体pET-30a的5‘端就没有了HIS标签。

在引物VP12（-）设计时，由于在CTCGAG酶切位点前少设计一个核苷酸，所以读码时的顺序是

C TCG AGC ACC ACC ACC ACC ACC AC.

而不是CTC GAG CAC CAC CAC CAC CAC CAC （表达出的蛋白带HIS标签）

也不是文中图1所示的

CT CGA GCA CCA CCA CCA CCA CCA C

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所以通过上述的分析，根据文献里提供的信息，构建的两个原核表达载体，表达出的蛋白都不具有HIS标签。
实验从一开始做引物设计出了问题，通过下面手段可以进行改进。

没有HIS标签的蛋白按说是不能用蛋白纯化试剂盒ProBond Purification System纯化出来蛋白的。