Identification of a Critical and Conformational Neutralizing Epitope in Human...

cl181117

讨论：
1、本文报道了针对HAdV-4的具有高中和活性的中和MAb，MN4b，其识别HVR7内的构象表位（HAdV-4六邻体中的氨基酸位置418至422）， 该表位是针对HAdV-4的NAb的关键靶标。MN4b对rAd3-A4R7-1的反应比HAdV-4弱得多，这可能归因于在HAdV-4六邻体和HAdV-3六邻体上展示时R7-1的构象差异。
2、文中的数据表明六邻体是诱导NAbs的主要HAdV-4抗原，这与先前报道（25-27）的数据一致。 然而，HAdV-4抗血清仍然中和了突变病毒。 因此，进一步的研究应该调查六邻体内的其他表位或其他衣壳蛋白，如纤维蛋白或五邻体基底，是否也是人血清中NAb的靶标。
3、MN4b识别HAdV-4并抑制HAdV-4的感染，但不抑制HAdV-3的感染（图1）。 因此，MN4b可用于区分HAdV-4与其他HAdV血清型。
4、MN4b具有3,200（约0.6μg/ ml）的高中和滴度，可能被人源化作为抗HAdV-4感染的治疗或预防剂（38）。 这个重要表位的识别可能有助于开发能够避免预存免疫的HAdV-4衣壳修饰载体（17,20,39）。
5、MN4b中和HAdV-4的机制尚不清楚。到目前为止，NAbs在抑制进入过程后期步骤方面的作用尚未得到很好的表征，需要进一步研究。

知识就是力量

一、针对HAdV-4六邻体的中和MAb MN4b的产生与鉴定
      纯化的HAdV-4病毒体用于免疫BALB / c小鼠并筛选得到针对HAdV-4的小鼠的MAb。在产生的六种抗HAdV-4 MAb中，只有单克隆IgG1同种型抗体MN4b在AD293细胞中对HAdV-4具有高中和活性。 通过针对HAdV-4病毒体的酶联免疫吸附（ELISA）测定MN4b的腹水滴度约为800,000。 MN4b对HAdV-4具有高达3,200（约0.6μg/ ml）的高中和滴度。 MN4b不中和HAdV-3，HAdV-7或HAdV-5，表明它是针对HAdV-4的血清型特异性NAb（数据未显示）。 间接ELISA表明MN4b与其亲本抗原，整个HAdV-4 GZ01病毒颗粒反应，表明MN4b识别的表位呈现在病毒粒子的表面上（图1A）。 MN4b没有与纯化的HAdV-3病毒粒子发生反应，也不与重组HAdV-4六邻体（Ad4hexon）肽（六邻体的氨基酸112至491）或在大肠杆菌中表达的纤维蛋白（Ad4FK）反应（图1A）。

      使用天然和变性的Western印迹分析来确定MN4b是否识别构象依赖性抗原。用纯化的HAdV-4颗粒进行蛋白质印迹，HAdV-4颗粒在室温（天然）（图1B，泳道3和7）或98℃（变性）（泳道4和8）暴露于1％SDS后电泳分离。在室温下，六邻体蛋白在SDS中保持其三聚体形式。 MN4b仅识别天然三聚体HAdV-4抗原（图1B，泳道3），而不识别在SDS存在下已加热至98℃的变性单体HAdV-4抗原（泳道4）。抗HAdV-4血清与天然HAdV-4抗原强烈反应（图1B，泳道7），但与变性HAdV-4抗原弱反应（泳道8）。纯化天然（图1B，泳道1,5和9）或变性（泳道2,6和10）HAdV-3病毒粒子用作对照。有趣的是，抗HAdV-3血清与天然HAdV-3抗原（图1B，泳道9）以及变性的HAdV-3抗原（泳道10）反应。 MN4b识别的抗原的分子量（图1B，泳道3）与主要衣壳蛋白，六邻体同源三聚体相似，后者被抗HAdV-4血清和抗HAdV-3血清识别（图1B，分别是泳道5和9）。


      用来自重组HAdV-4六邻体（Ad4hexon）肽免疫的小鼠的抗血清进行进一步的Western印迹分析在大肠杆菌中表达的HAdV-4六邻体证实MN4b检测到六邻体同源三聚体（图1C）。这些结果表明MN4b识别六邻体同源三聚体上的构象依赖性表位。

C:\Users\Administrator\Desktop

知识就是力量

二、定位HAdV-4六邻体的潜在中和表位区域
      以前的研究表明，腺病毒血清型特异性NAb识别的表位暴露在病毒体表面，并存在于六邻体蛋白的七个HVR中（1,17）。 将HAdV-4六邻体的一级氨基酸序列提交至SWISS-MODEL工作空间用于同源建模。使用序列比对数据和构建的HAdV-4六邻体模型（图2A），预测暴露在衣壳表面上并位于HVR中长度为6至15个氨基酸的四个小表面环为抗原表位，作为NAb识别的潜在位点， 这些潜在的中和位点分别位于六邻体的HVR1[残基136至142]，HVR2[残基164至176]，HVR5 [残基256至267]和HVR7-1[残基418至422]内（图2B）。

知识就是力量

三、构建嵌合腺病毒rAd3-A4R1，rAd3-A4R2，rAd3-A4R5和rAd3-A4R7-1
      使用引物对A4HVR1u / HexD，A4HVR1r / HexU和HexU / HexD以pBRAd3dE3GFP作为DNA模板，用重叠PCR延伸诱变产生突变片段H3A4R1。然后将H3A4R1片段克隆到pBRLR中以产生穿梭载体pBRLR-H3A4R1。用相同的策略构建rAd3-A4R2，rAd3-A4R5和rAd3-A4R7-1。  最后，将LR-H3A4R1片段克隆到pBRAd3dE3GFP载体中，使用同源重组技术在大肠杆菌菌株BJ5183中产生HAdV-3六邻体HVR1诱变载体pBRAd3E-A4R1。通过限制性消化和DNA测序分析证实了这些构建体。用AsiSI消化这些质粒以使基因组DNA线性化，然后用Lipofectamine LTX和Plus试剂（Invitrogen，USA）转染AD293细胞。将转染的细胞在37℃，5％CO2下培养6至10天，每天检查细胞病变效应（CPE）。将细胞冻融三次。收集细胞悬浮液，然后用于感染细胞。在感染后96小时，收获病毒并命名为rAd3-A4R1，rAd3-A4R2，rAd3-A4R5和rAd3-A4R7-1。最后，将突变病毒与AD293细胞一起培养在20个培养皿（100mm）中，收获，并用标准CsCl梯度离心纯化。通过DNA测序确认病毒的修饰的六邻体基因。      通过将预测的HAdV-4表位肽整合到HAdV-3六邻体的相应表面环中来构建四个掺入表位的重组腺病毒（图3A）。  ELISA显示MN4b识别rAd3-A4R7-1但不与其他重组病毒反应（图3B）。用连续稀释的MN4b进行的进一步测试证实了这些结果（图3C），这表明MN4b检测到HVR7中的构象依赖性表位。

为了确定这四个位点是否含有中和表位，通过用掺入表位的重组腺病毒rAd3-A4R1，rAd3-A4R2，rAd3-A4R5或rAd3-A4R7-1免疫小鼠产生抗血清。 中和试验显示仅抗-rAd3-A4R7-1血清和阳性对照抗-HAdV-4抑制HAdV-4对AD293细胞的感染（图4）。 因此，仅A4R7-1表位诱导针对HAdV-4的NAb，并且是HAdV-4的重要中和表位。 进一步的中和试验显示，在四种嵌合腺病毒中，只有rAd3-A4R7-1被小鼠抗HAdV-4血清中和（数据未显示）。