Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real- Time Quantitative PCR

真核表达

以fig 2的数据为例，在每一时间点上分别取了三个独立的 RNA 样本进行了分析。对每一个样本进行分别处理，用2^-△△Ct方法需要对每个样品进行计算，取平均值。如果是同一样本进行三个复孔检测，先求出平均 Ct，然后再进行计算。
如何计算平均值需要看目标基因和内参基因是在同一个管子中扩增还是在不同的管子中扩增。


表 1 显示靶标基因（c- myc ）和内参基因（GAPDH ）在不同管中进行扩增的实验数据。该数据中不能把单一的相对特殊的 c-myc 管和 GAPDH 管进行比较。正确的计算方法是：首先分别计算出不同样本的 c-myc 和GAPDH 的平均 Ct值，然后计算△Ct值。

重复实验中 Ct值的估计偏差是通过标准的指数法计算最後结果中相对量的变化。其中的一个难点是 Ct 值与相应的拷贝数成指数关系，因此，在最后的计算中，误差是通过△△CT加减标准差来评估，这就使得求得的数值相对于平均值呈不对称分布，不对称分布是因为结果经指数处理后进行线性转化比较而造成的。

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通过用不同荧光染料分别标记靶标基因和内参基因的探针，可以在同一管中同时扩增靶标序列和内参序列。表 2 给出了目标基因（c- myc）和内标基因（GAPDH）在同一管中扩增的实验数据。

对于任意一个管子，目标基因（c-myc）和内参基因（GAPDH）扩增时加入的 cDNA 量都是一样多的，所以可以对每个管子计算△CT 值，这些值取平均后再进行计算。 在这里估计误差值也是一个不对称的范围，反映了误差经指数处理转化为线性差异。

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表 1 和表 2 中，我们可以看到△CT和△△CT两列的数值中，估计误差并没有变化，这是因为我们把参照品和实验组样品的误差都显示出来了。

我们把△CT，cb当作一个人为设定的常数来减实验组去，得到△△CT 。这样得到的结果就与图 2 所显示的在求平均之前对不同重复样本分别通过各自的 CT 值求实所得结果 相当。

另一种方法是将参照基因当作没有任何误差的 1 倍的量，在这种情况下，平均△CT,cb的误差值被引入到每一样本的△△CT中。在表 1 中，肾脏中△△CT  变成- 2.50±0.20 而经过校正的 c-myc 量是 5.6 倍，范围从 4.9 到5.6 。而在大脑中的结果是没有误差的 1 倍。

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2. 2^－△CT方法

2.1. 2－△CT方法的推导

通过内标 RNA 可以对加入 RNA 的量的差异进行校正。2^－△△CT 方法的数据分析的一个特点就是能够利用实时 PCR 实验的一部分数据来完成这种校正。在其它的方法不能定量初始 RNA 量的时候：例如，在能得到的 RNA 量非常有限的时候或者需要处理高通量的样品的时候，这一方法的优势就格外明显。PCR 实验以外的方法也可以完成这种校正。最常用的一种方法就是用紫外吸收来确定用于cDNA 合成的 RNA 量，然后将相同的 RNA 反转录产生的 cDNA 用于 PCR 定量反应。这种外标法校正的一个应用例子就是研究某种实验处理是否影响内标基因的表达。在这里，靶标基因和内参基因合二为一。

和公式[5]不同，公式[2]不被公式[3] 除。

任一样品 X0,q 除以参照品 X0,cb 得：在这里△ C't=Ct,q-Ct,cb 。△C’T 与前面计算中用的△CT（用目标基因 CT 值减去参照基因 CT 值）相互区别。

就象在 1.1 部分所描述的，如果条件优化较好，效率接近于 1，内标相对于参照因子为公式[13]

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2.2. 2－△Cf 方法的应用

2－△CT'方法的一个应用就是确定实验处理对某一候选内标基因的影响。为了显示这一过程，我们做了血清饥饿/ 诱导实验 。
血清饥饿/ 诱导是研究某些 mRNA 降解的常用方法。然而，血清可能影响一些基因的表达包括标准的看家基因的表达。
在24-h 血清饥饿培养之後，在NIH 3T3 细胞中加入15% 血清诱导基因表达。从细胞中提取Poly(A)+RNA ，并将之反转录成 cDNA 。利用 SYBR Green 通过实时定量 PCR 检测 GAPDH ，β 2 -microglobulin cDNA 的量。
GAPDH 和 β2 -microglobulin 各自的相对量通过 2－△CT'公式求得。细胞处理对于 GAPDH 的基因表达有明显影响，但对 β2-microglobulin 没有什么影响。因此 β2-microglobulin 很适合做血清刺激定量实验的内标，而GAPDH 并不适合。这一例子向大家展示了在只研究一个基因的时候怎么用 2－△CT'的方法分析基因相对表达数据。

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3.  实时 PCR 数据的统计学分析

实时 PCR 最终分析的是阈值循环或 CT。

CT 值通过 PCR 信号的对数值和循环数来确定。因此 CT 值是一个指数而非线性概念。因此，在任何

统计分析中都不要用原始的 CT 值来表示结果。正如我们在前文中所描述的一样，PCR 相对量通常和内标

和参照样本一起计算而很少直接用 CT 值来表示，除非我们想检验重复样本之间的差别。为了向大家显示这

一点，我们用 SYBR Green 通过 real-time PCR 来检测相同 cDNA 的 96 个重复反应。所有反应组分在

同一管中混好後分装到 96个管中，做实时PCR 分析，得到了每一个样本的 CT 值。为了比较样品间

变化，计算了96 个样本的平均±SD，如果通过原始CT 值计算，平均 ±SD 是20.00±0.193，CV 为0.971% 。

但是如果把原始 CT 值用 2 -CT 转化成线性形式，平均±SD 是 9.08 × 10-7 ±1.33 × 10-7，CV 为 13.5 %。

从这个简单的例子我们可以看出，通过原始CT 值来反映变化是错误的，应该避免。用 2－CT 将单个数据转

化成线性形式来说明重复样本之间的变化和差异更准确可靠。

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4.  结论实时定量 PCR 实验设计和数据分析可以采用相对定量和绝对定量两种方法，研究人员在设计实时定

量PCR实验分析基因表达的时候首先要问的一个问题就是：数据最後会以一个什么样的形式得到。如果需要知道绝对的拷贝数，就必须用绝对定量的方法，否则只需要给出基因表达相对量就足够了。相对定量可能比绝对定量要更容易一些，因为它不需要作标准曲线。

本文所给出的公式对于每个用相对定量的方法分析基因表达差异的研究人员都足够了。下面，我们总结一下实验设计和评估中的一些重要步骤：

选择一个内标基因。

确定内标的有效性，确保它不会受到实验处理的影响。

通过 PCR 扩增目标基因和内标基因 RNA 或 cDNA 的一系列梯度稀释模板确保它们的扩增效率相

同。

最後通过 2－△CT 计算将统计数据转化成线性形式而不是原始 CT 值。