0011-0021 杂交瘤技术制备单克隆抗体实验流程

黄帮主

STEP 5: 腹水型单抗的纯化
抗体纯化是指从生物原料如抗血清, 单克隆杂交瘤细胞培养上清, 小鼠腹水等中通过一定的物理或化学方法获取具有生物活性的高纯度目的抗体的过程。杂交瘤产生的免疫球蛋白主要是IgG和IgM，究竟是哪种为主，则决定于抗原的免疫程序。免疫一次，且3天后就取脾，多为产生IgM的B淋巴细胞。免疫多次的多为IgG。实验室常规杂交瘤技术从小鼠腹水中纯化抗体，基本以IgG为主。
蛋白的纯化工作非常复杂, 既要保证纯度, 又必须保持其生物活性。较为常规的抗体纯化方法有饱和硫酸铵沉淀（SAS）, 聚乙二醇沉淀, 辛酸-硫酸铵，离子交换, 分子筛, 亲和层析, MEP层析, Protein A/G，免疫磁珠等方法。每种蛋白质的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异,按纯化后蛋白的需求不同采用相应的纯化方法。目前，对于腹水型单抗的纯化普遍采用的方法是将硫酸铵沉淀与亲和层析法结合起来，即先采用硫酸铵盐析法粗提，再经亲和层析得到较纯的IgG。
操作流程如附件PROTOCOL
登录后即可下载文件。

黄帮主

STEP 6: 单抗鉴定--杂交瘤细胞的染色体计数分析
杂交瘤细胞在培养过程中，编码抗体的染色体容易丢失，因此在杂交瘤及单抗研究中，细胞遗传分析技术在鉴定杂交瘤、观察细胞株突变、探索抗体特性等方面均具有重要价值。正常鼠的脾细胞染色体数为40，小鼠骨髓瘤细胞染色体：SP2/0细胞为62—68，NS-1为54～64条。杂交瘤细胞的染色体数目接近两亲本细胞染色体数目的总和，染色体数目多且较集中的杂交瘤细胞分泌高效价的抗体。
操作流程如附件PROTOCOL
登录后即可下载文件。

黄帮主

STEP 7: 鼠单抗类型鉴定--双向琼脂扩散法实验
鼠单抗的类和亚类鉴定对后续研究有指导意义。最常见的单抗是IgG和IgM，分泌IgE的杂交瘤细胞很少见。鉴定单抗Ig类和亚类的方法可以有免疫扩散法，ELISA，检测卡检测，可以区分出IgG1\IgG2a\IgG2b\IgG3\IgM\IgA。免疫扩散法简便，准确，腹水中的抗体虽然浓度高，但是含有小鼠本身的各类Ig，扰乱鉴定结果，因此不能用腹水作为被检样品。通常以杂交瘤细胞的培养上清液作为被检样品，使用时将上清液浓缩10-20倍再进行检测。
操作流程如附件PROTOCOL
登录后即可下载文件。

黄帮主

STEP 7: 鼠单抗类型鉴定--ELISA和检测卡
目前市面上商品化试小鼠单抗Ig分型试剂盒主要分两类，一种是ELISA检测，利用双抗体夹心法鉴定小鼠淋巴细胞杂交瘤培养上清中单克隆抗体或特异亲和纯化的单克隆抗体的类和亚类（可区分出IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM和IgA）。另一种是使用分型试纸条，预先固定亚类和轻链特异性抗小鼠Ig抗体，试纸条上固定的抗小鼠抗体，能与各种常见的小鼠抗体同种型（IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM和IgA）以及轻链发生特异性结合。

操作流程如附件PROTOCOL

登录后即可下载文件。

黄帮主

STEP 8：鼠单抗轻重链的可变区的克隆--杂交瘤细胞轻重链可变区克隆-RT-PCR

从分泌单抗的杂交瘤细胞中克隆单抗轻重链可变区的常用方法有两种：RT-PCR和5′-RACE法。RT-PCR法利用鼠源Ig可变区的特异性引物，由于可变区序列存在相当丰富的多样性，因此引物设计要针对可变区中的保守序列。5′端引物一般设计在可变区的引导序列，也可设计在FR1区；3′端引物设计在重链或者轻链的恒定区。引物设计不一定要和基因序列完全匹配，可以带有简并引物。

操作流程如附件PROTOCOL

登录后即可下载文件。

黄帮主

STEP 9：单抗理化特性的鉴定--亲和常数测定

抗体亲合力是指抗体与抗原或半抗原结合的强度，是评价抗体性质的最重要的指标之一，其高低主要是由抗原和抗体分子大小，以及抗体分子与抗原决定簇结合的立体构象决定。亲和力的高低通常以结合常数（Ka）或解离常数（Kd）表示，Ka的单位是L/mol，Kd的单位是mol/L，两者互为倒数。Ka值越大，表示抗体的亲和力越高；相反，Kd值越大，则表示抗体的亲和力越低。

单抗亲合力测定是十分重要的，它可为正确选择不同用途的单抗提供依据。在建立各种检测方法时，应选用高亲合力的单抗，以提高敏感性和特异性，并可节省试剂。而在亲和层析时，应选用亲合力适中的单抗作为免疫吸附剂，因为亲合力过低不易吸附，亲合力过高不易洗脱。

操作流程如附件PROTOCOL
登录后即可下载文件。

黄帮主

已收录至公众号

黄帮主

饲养细胞采用未经抗原免疫的正常BALB/C小鼠的腹腔巨噬细胞。
意义在于：
①  提供其它细胞生长所需的生长因子；
② 可以清除死亡细胞碎屑，达到清除有害物质的目的。

黄帮主

02001：
单抗腹水的制备：
取成年的Balb/C小鼠，于腹腔内预先注入0.5ml的弗氏不完全佐剂。
1周后，0.5ml的3×10^5个细胞的剂量注入小鼠的腹腔。
7天左右，当小鼠的腹腔增大时，抽取腹水，5000rpm/min离心取上清，-20℃备用。