|
|
楼主 |
发表于 2019-9-18 09:30:32
|
显示全部楼层
本帖最后由 cl181117 于 2019-9-18 09:56 编辑
背景介绍：
脊髓性肌萎缩症（SMA）是一种常染色体隐性遗传疾病，也是最常见的神经肌肉疾病之一。在大多数人群中，发生率为 10,000 分之一，携带者约为 2％。患者脊髓前角细胞的退化导致进行性近端肌肉萎缩和虚弱。临床上有三种亚型。在 I 型 SMA（Werdnig-Hoffmann 病，MIM253300）中，症状在出生后的头几个月开始。患者从不坐着或独立行走，并且通常在 2 岁之前死于呼吸衰竭。患有 II 型SMA（MIM253550）的患者在 6 个月大之后出现，不能独立行走。在 III型（Kugelberg-Welander 病，MIM253400）中，症状出现在 2 岁之后，有时在成年后期。 所有三种临床类型的 SMA 都与染色体 5q13 上的运动神经元（SMN）基因座的突变相关。通常，该区域含有一个端粒 SMN1 基因（MIM600354）和一个着丝粒旁系同源物 SMN2（MIM601627）。SMN1 和 SMN2 的编码序列的差异仅在于在 cDNA 残基 840 处外显子 7 中的同义点突变。在该核苷酸位置，SMN1为C， SMN2 为T 。该单核苷酸差异不影响蛋白质序列。然而，SMN2 中该位置的 T 残基降低了外显子 7 的剪接效率。由于缺乏外显子7， 大多数 SMN2转录物无活性，但一小部分是正常的。
在 94％的 SMA 等位基因中，SMN1 不存在，如 cDNA 位置 840（SMN1中的 C，SMN2 中的 T）中的基因型所定义。这可以通过真正的缺失或通过基因转化为 SMN2 而产生。剩余的 SMA 等位基因在 SMN1 中含有小的基因内突变。在某些情况下，SMA 的症状可能是由其他基因座的突变引起的。具有纯合缺失 SMN1 但具有高 SMN2 拷贝数的患者具有比预期更温和的表型，可能是因为有一小部分是正常的。与 SMN1 拷贝数不同，SMN2 拷贝数的确定不直接预测临床过程，并且通常不包括在临床报告中，但在某些情况下它是有用的。对于诊断和精确残留风险计算，准确确定 SMN1 和 SMN2 的拷贝数是最佳的。
SMN1 和 SMN2 基因序列的近似同一性使得 SMN1 拷贝数的确定复杂化。C840T序列由Drai切割而成。定性PCR和Drai酶切可以检测SMN 1的纯合缺失。放射性定量PCR、DRAI消化和定量是最早报道的定量方法之一，但工作量大，涉及辐射暴露。最近的 SMN 剂量定量方法使用实时定量 PCR。其中，在整个扩增反应中记录对每个 PCR 反应并且与扩增的 DNA 量成比例的荧光标记物的释放，而不是像在先前的定量 PCR 方法中一样在反应结束时记录。该方法的关键参数包括在基线以上可检测到指数扩增的 Ct（阈值循环）和 Rn（标准化报道分子），这是反应结束时总扩增的指示。在扩增的早期指数周期中估计 DNA 拷贝数避免了在最终扩增循环中可能出现的潜在伪影，此时可以耗尽诸如 dNTP 的底物并且存在大量的反应产物。 Feldkötter 等人提出了 SMN1 和 SMN2 的引物特异性扩增方法。该技术需要 PCR 产物的绝对定量。因此，DNA 分离和定量的效率是主要变量。另一种方法使用 TaqMan 探针将 SMN1 与 SMN2 区分开来，其中因子VIII 基因作为内部对照。因子 VIII 是 X 染色体基因。因此，需要对所测试个体的性别进行调整。在该方法中，SMN1 和 SMN2 在两个独立的反应中定量。Gomez-Curet 等使用 CFTR（一种常染色体基因）作为内部对照发表了双重 PCR 分析。然而，对照在同时但不同的反应中被扩增。Passon 等人还发表了双重测定，使用 ALB 作为内部参考基因。在准备本文期间，发布了有用的实践指南。我们提出了一种准确、快速、可靠的检测SMN 1和SMN 2拷贝数的三重定量实时PCR方法，并总结了我们6年来使用该技术的经验。 |
|
发表于 2019-9-16 14:31:40
