Human Neutralizing Fab Molecules against Severe Acute ......

傲慢与偏见

Human Neutralizing Fab Molecules against Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Generated by Phage Display

傲慢与偏见

摘要：以SARS恢复期病人血制备人免疫Fab抗体库，从中筛选针对刺突蛋白的抗体，得到12株ELISA检测能与S蛋白结合的抗体，中和实验显示其中一株M1A能在Vero E6细胞中显示对SARS-CoV的中和活性，DNA测序显示M1A轻重链分别为K2a和4f家族，0.5 mg/ml的M1A能完全抑制 SARS-CoV活性，7天内无CPE，荧光定量PCR结果和中和实验结果一致。

傲慢与偏见

在2002年-2003年，世界范围内爆发SARS，没有有效的药物进行治疗。
有研究显示SARS患者输入恢复期患者的血清能有效缓解病情。
因此有理由认为研制SARS单抗对被动免疫有效。S刺突蛋白是SARS病毒的一个重要靶蛋白。
本研究通过构建免疫抗体库，筛选针对S蛋白的抗体，并进行一些活性鉴定。

傲慢与偏见

构建Fab噬菌体抗体库
从SARS恢复期患者全血中提取总RNA，RT-PCR获得Fd基因和轻链基因，构建Fab免疫抗体库，骨架载体为 pComb3。宿主菌为XL1-Blue，库容为2×10^6。

傲慢与偏见

淘选：
ELISA板包被纯化的SARS-CoV (Beijing 01株)裂解物抗原(30 ug/ml)，3%BSA-PBS封闭，噬菌体库投入量5×10^12 CFU/ml。
第三轮，第四轮筛选时，用293T表达的SARS-CoV刺突蛋白进行筛选。
筛选到的噬菌粒载体切掉PIII蛋白，原核表达FAB抗体蛋白，ELISA检测和S蛋白的结合能力。

傲慢与偏见

四轮淘选后，随机挑选50个克隆，用双夹心ELISA法鉴定上清中的FAB，12个克隆显示出和S蛋白有结合活性，进一步对12株克隆进行中和活性鉴定，通过观察细胞的CPE变化，结果显示M1A株对SARS-CoV有部分中和能力。

傲慢与偏见

序列测定：
VL和VH区域分别用引物进行测序
T7 引物： 5-GTAATACGACTCACTATAGGG-3
T3 引物：5-AATTAACCCTCACTAAAG-3
可变区序列为

傲慢与偏见

原核表达M1A蛋白：
M1A抗体的VH和VL基因克隆至PET32a载体中，进行原核表达。
溴化氢活化的亲和柱进行蛋白纯化，蛋白电泳显示分子大小为48,000Mr. 。
浓缩后产量为10mg。

傲慢与偏见

双夹心ELISA
ELISA板包被兔抗-S蛋白血清，同时设置包被BSA或者Vero E6细胞裂解物作为阴性对照孔。
加入SARS-CoV裂解抗原捕获住S蛋白，将其他蛋白清洗掉。
再加入粗提的Fab抗体。


间接ELISA
在检测M1A抗原和S蛋白的结合能力时，用293T表达的S蛋白包被ELISA板，同时设置包被BSA或者Vero E6细胞裂解物作为阴性对照孔。
M1A进行等比稀释（0.025-0.2mg/ml）和S蛋白结合。
HRP-标记的山羊抗人Fab作为二抗。

傲慢与偏见

病毒中和能力检测
MNT实验检测Fab抑制SARS病毒的感染力。粗制Fabs或者2倍稀释(1 mg/ml-0.0625 mg/ml) 的纯化M1A和等体积的SARS-CoV（2,000 PFU/ml）混合，接种到Vero E6细胞单层上，观察细胞病变情况。