Potent neutralization of severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus...

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Potent neutralization of severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus by a human mAb to S1 protein that blocks receptor association

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本文中鉴定了8个从人天然抗体库中筛选到的针对SARS病毒S1蛋白的重组人单链抗体，其中一株80R能有效中和SARS病毒，抑制表达S蛋白的细胞和表达ACE2受体的细胞产生合胞反应，80R抗体的表位经鉴定位于S蛋白的N端261-272位，没有糖基化依赖性。
80R单链抗体和S1蛋白有很高的亲和力，与ACE2之间竞争结合S1蛋白。
改构为全抗后和S1的亲合力进一步提高，和ACE2与S1蛋白的亲合力相比较高20倍。
80R抗体是一个能抑制病毒进入细胞的抑制剂，S1蛋白的ACE2结合位点可能是研制亚单位疫苗和药物开发的有意义的靶点。

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研究背景：
SARS无有效疫苗和治疗药物。
恢复期SARS患者血清中存在大量的保护性中和抗体IgG。
用SARS已感染者血清治疗SARS患者能有临床治疗作用。
这些数据说明用中和抗体被动免疫有效。
本研究以S1蛋白为靶标，筛选鉴定其中和抗体。

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蛋白表达：
① SARS的S1蛋白12-672位-Fc融合蛋白
② SARS的S1蛋白12-327位-Fc融合蛋白
③ SARS的S1蛋白261-672位-Fc融合蛋白
转染293-T瞬时表达，A柱纯化。
④ SARS的S1蛋白12-672位-C9的C末端融合蛋白，用加抗-C9抗体1D4的凝胶A柱纯化。

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噬菌体抗体库的构建和筛选
用57个健康人B细胞样本，构建了两个人非免疫抗体库，总库容为2.7×10^10。
以S1-C9为靶抗原，首轮5×10^11cfu，三轮筛选后，鉴定288个克隆，104个phage-ELISA为阳性。
其中有8个不同的SCFV序列，6A/8C/12E/26H/27D/80R/91M/92N
6A轻链CDR3缺失。
8株SCFV序列插入到原核表达载体中，进行原核表达，纯化。

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微中和实验
在96孔细胞板中预先加入稀释抗体，加37pfuSARS活病毒。37℃孵育1小时，铺VERO E6细胞，37℃培养3-4天，染色，观察细胞有无被病毒感染，有无被抗体保护。如图：相对深色孔代表细胞被保护，浅色孔代表病毒有入侵细胞，细胞被破坏。三个复孔中两孔和两孔以上呈浅色时稀释度被界定为终点。

单链抗体中，80R（VH3/VK3）显示有中和活性，如上图，con SCFV对照孔，其他的无关中和单抗对照孔27D，以及无关血清对照孔不能对细胞有保护作用，80R单抗孔和患者恢复期血清能有效保护细胞，显示出中和活性。
单抗分子小，在血液中容易被清除，在被动免疫中使用受限。
进一步将80R单抗改造成全抗。

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SPR检测80R单抗，全抗，ACE2和S1-IG的解离常数，结合常数和亲和力。
80R单抗，全抗，ACE2和S1-IG的亲和力分别为32.3，1.59，1.7nM。
微中和实验和biacore结果比较一致，全抗和S1蛋白的亲和力和单抗比，提高20倍左右。

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抗S1抗体的抑制合胞体形成实验
293T细胞，转染表达SARS S蛋白或者ACE2的真核表达载体。
转染后一天，细胞分别用胰酶消化。
表达S蛋白的细胞和0，25，50，100nM的8株抗-S1单抗或者80R全抗预先孵育10min，和表达ACE2的细胞进行混合。
重新接种到24孔板中，孵育后36小时，开始观察合胞体的形成。
如图，无关蛋白的中和抗体不能抑制合胞体的形成，另外7株抗-S1单抗也不能抑制合胞体形成。
80R单抗和全抗则能抑制合胞体形成。

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流式检测抗体对S1蛋白和VERO-E6细胞的抑制作用
40ul体系中加入Scfv（0，5，15，30ug/ml）和15ug/ml的S1-Ig（以S1-327-Ig作为阴性对照，S1-327-Ig和ACE2不结合）混合，4℃作用1小时。
混合物和2×10^5个VERO-E6细胞混合孵育，4℃作用1小时。
PBS洗涤细胞后，加FITC-山羊抗人IgG作为二抗，4℃作用半小时。
PBS洗涤细胞，用流式检测。

由图可见80R的SCFV单抗能有效抑制S1蛋白和VERO细胞的结合。

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免疫沉降实验检测抗体对S1蛋白和可溶性ACE2蛋白结合的抑制作用
S1-Ig（1.5ug）和不同量的Scfv（0.1，0.5，1.5，4.5ug）结合，4℃孵育1小时。实验组为抗S1蛋白的单抗80R ScFv
对照组为抗无关蛋白单抗27D ScFv
阳性对照为最右边一组，加抗-ACE2

结合上面所有的数据，证实80R抗体是通过阻断S1蛋白和ACE2结合，而具有中和活性。