SARS病毒Spike蛋白重组腺病毒疫苗的构建 及其免疫学分析

真核表达

SARS病毒Spike蛋白重组腺病毒疫苗的构建及其免疫学分析

真核表达

摘要笔记：
目的：构建基于SARS病毒Spike(S)蛋白的重组腺病毒。
方法 ：通过全基因合成得到全长s蛋白基因，利用Ad5腺病毒系统构建s蛋白基因的重组腺病毒，采用间接免疫荧光
(IFA)试验和蛋白免疫印迹法(Western blot)对S蛋白的表达进行鉴定，再用重组腺病毒免疫小鼠，观察小鼠抗体诱生情
况，从而对该重组腺病毒的免疫效果进行初步评价。 结果PCR扩增重组腺病毒质粒外源片段，大小为800 bp，与预
期值一致；Western blot和IFA结果表明，重组腺病毒(rAd—s)表达s蛋白能被马抗SARS血清识别；ELISA检测结果显
示，rAd～S能刺激小鼠机体产生抗体。 结论重组腺病毒系统成功表达了SARS病毒s蛋白，免疫小鼠产生s蛋白特
异的抗体。

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背景资料摘要：

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实验用材料：
腺病毒骨架质粒pADEasy-1
穿梭载体pShuttle-CMV质粒
带有腺病毒骨架质粒的BJ5183菌株
腺病毒包装细胞AD293
克隆有SARS S蛋白基因4个DNA片段的质粒pKS-fl、pKS-f2、pKS-f3和pKS-f4
根据SARS香港株的S蛋白基因序列经密码子优化后合成的4条序列分别为f1、f2、f3和f4。利用每两个片段之间的酶切位点进行连接，得到S蛋白全长序列。
293和293T 细胞

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SARS S 蛋白基因的拼接和导入穿梭载体pSUTTLE-CMV中。
构建了3个穿梭载体，分别是S全长蛋白以及S1,S2两个蛋白。后文中并未见到S1,S2蛋白用于重组腺病毒的包装。

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重组腺病毒质粒的获得：
穿梭质粒用pme I线性化后并且去磷，电转已经转化腺病毒骨架载体质粒的BJ5183感受态细菌。
通过同源重组的方法获得插入SARS S蛋白的重组腺病毒质粒。
经酶切鉴定和PCR扩增鉴定正确。

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线性化重组质粒转染AD293细胞，进行包装和成毒。
10ug的质粒线性化后，纯化，转染AD293细胞。
37℃孵育7-14天，收上清，感染下一代，得到较高滴度的重组病毒。

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Western blot检测外源蛋白的表达 IFA检测S蛋白的表达
如图
WB能检测到S蛋白，但是IFA图不甚清楚，注释也没有标，放大倍数（×40)也可能不对。

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动物实验：
BalB/c小鼠，雌性，6-8周龄，随机分5组，每组六只。
①：每只小鼠注射1×10^8 pfu重组腺病毒rAd—S；
②：每只小鼠注射5×10^7 pfu重组腺病毒；
③：每只小鼠注射未经重组的腺病毒(Ad)1×10^8 pfu；
④：每只小鼠注射未经重组的腺病毒(Ad)5×10^7 pfu；
⑤：PBS。
共免疫3次，间隔2周。免疫前、加强免疫前和免疫后每2周取血1次，直至免疫后第14周为止
包被S2蛋白，用于elisa检测血清中特异性抗体。