Stabilization of a Full-Length Infectious cDNA Clone of Transmissible

傲慢与偏见

Stabilization of a Full-Length Infectious cDNA Clone of Transmissible Gastroenteritis Coronavirus by Insertion of an Intron

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将传染性肠胃炎冠状病毒cDNA基因组中插入内含子结构构建得到BAC载体，内含子的插入有效打断了基因组中的毒性区域。病毒RNA在细胞核中受CMV启动子调控进行表达，在RNA转移到胞浆过程中，内含子有效被切除掉。
在两个不同位点插入的内含子使得质粒能够稳定的扩增近200代，修饰后的cDNAs转染细胞后能有效得到感染性TGEV病毒。

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冠状病毒是一种有包膜，单股正链RNA病毒，属于套式病毒目。冠状病毒基因组约30Kb,是最大的RNA病毒。
构建的cDNA克隆包括传染性胃肠炎冠状病毒(TGEV)，人冠状病毒229E株和传染性支气管炎病毒。
用于进行冠状病毒基因组的基因功能研究，开发为表达载体等。
构建这些cDNA克隆中遇到的问题是基因组长度太大，在细菌中稳定性不好。
将全长TGEV的cDNA序列作为一个细菌人工染色体转入大肠杆菌，在细菌中的数量比较少，对细菌的毒性降低。
不过，这种方法依旧残留有一定的毒性，可能和cDNA中的ORF1a3末端的序列有关。
质粒在细菌中增值80代时能观察到这种不稳定性。
插入内含子是一种增加质粒稳定性的策略。
本研究，报道了在全长TGEV cDNA中的两个位点插入一段133核苷酸序列的内含子序列，转染细胞后依旧获得拯救病毒。

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构建TGEV的cDNA克隆：在之前缺陷型小基因组DI-C的基础上进行cDNA克隆构建, 保留有复制能力。TBEV cDNA基因组序列组装到CMV启动子下游，进入细胞核后在核RNA聚合酶II的作用下，在核内表达病毒RNA。
小基因组DI-C和全长TGEV基因组相比较有三处缺失。
因此需要补回去构建cDNA全长克隆。
第一处缺失在ORF 1a (Δ1, 包括nt 2145-12194)
第二处缺失在ORF 1b (Δ2, 包括nt 16735-17842)
第三处缺失在结构蛋白处 (Δ3, 包括nt 20373-28086)

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通过RT-PCR扩增得到基因序列插入到DI-C中的缺失处。为了得到一个优化的复制酶基因，DI-C基因组上的核苷酸改造成TGEV PUR46-MAD基因组的序列。在构建过程中，除了Δ1中的Δ1-5‘ (nt 9349-11173)这段区域外，其他缺失区域都能正确插入。
在实验中得到的一些质粒中，发现在9711-10009区域出现终止密码子，小片段插入或缺失时，打断ORF读码框，质粒则比较稳定。
这段序列包括jCD片段（8978-9758 ），sD1-5片段（nt 9581-11173）. 两个片段，以及两个片段融合后的片段都是非常稳定，没有毒性。在构建全长cDNA克隆时，先缺失这一段基因序列，剩余部分进行cDNA克隆的构建。
最后通过Cla I进行酶切，得到的ClaI4417-ClaI9615酶切片段，插入到缺失这一段序列的TGEV基因组中，质粒载体选用低拷贝载体pACNR1180(10-12拷贝/细菌) 。
将TGEV基因组更换到BAC载体 pBeloBAC11中，这种BAC在每个细菌中只有1-2拷贝，并且证实可以稳定地耐受大于300kb以上序列。
结果获得了TGEV的全长cDNA克隆 (pBAC-TGEVFL) ，并且能够在 DH10B细菌中稳定传代80代以上.

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构建全长TGEV cDNA克隆的过程：在DI-C cDNA的基础上进行构建。
图中TGEV基因组下方的斜纹带代表DI-C的基因序列，中间缺失的分别为Δ-1(10 kb)，Δ-2(1.1 kb)，Δ-3 (7.7 kb)三段序列。
TGEV cDNA上的字母分别代表不同的病毒基因，L, 前导序列; UTR, 非编码序列.
DI-C cDNA下的数字和TEGV基因组上一致。

① Δ-1缺失的部分可以由6个片段进行拼接。
A1–5, A1-3, B1, C1, D1-5, D1-3
其中，D1-5 (nt 9349-1173)不能够稳定地插入到质粒中。
B1, C1, 和jCD组装后的片段（4310-9758）构建得到质粒pAC-TGEVClaI。
Cla I酶切后得到的ClaI4417-ClaI9615酶切片段插入到 pBeloBAC11中，构建得到pBAC-TGEVClaI。
A1-5，A1-3片段和CMV启动子--TGEV的5’端片段构建得到质粒pAC-CMV-A1+。

sD1-5，D1-3和ORF 1b的5‘端融合后构建得到质粒pSL-sD1+。
pAC-CMV-A1+和pSL-sD1+再进行融合构建得到质粒pAC-CMV-DIA-88，该质粒缺失两个Cla I酶切位点之间的片段。

② Δ-2缺失的部分由A2片段进行填补。构建得到含ORF 1b部分序列的亚克隆质粒pBS-RB3。
pAC-CMV-DIA-88和pBS-RB3进行连接，得到质粒pAC-CMV-DIA-157-BGH。
③ Δ-3缺失的部分由7个片段A3-G3进行填补。
A3-G3片段进行连接构建得到质粒pSL-SC11-3EMN7C8。
其中S基因来源于PUR46-C11 TGEV病毒株(SC11)。
3, E, M, N, 7基因来源于PUR46-C8病毒株(3EMN7C8)。
pSL-SC11-3EMN7C8质粒再加入一个包括24个nt合成的poly(A)，HDVr (Rz)，BGH终止子序列，构建得到pSL-SC11-3EMN7C8-BGH。
将几个质粒中的片段再进行连接，组合到低拷贝质粒pACNR1180中，得到仅仅缺失ClaI4417-ClaI9615的全长cDNA克隆。
为了提高该质粒的稳定性，将病毒基因组序列再插入到pBeloBAC11中，构建得到质粒pBAC-TGEVΔClaI。
最终，从pBAC-TGEVClaI中通过Cla I酶进行酶切得到的片段插入到ClaI-线性化的pBAC-TGEV-ΔClaI，构建得全长cDNA片段pBAC-TGEVFL。

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大肠杆菌中的稳定的全长cDNA克隆pBAC-TGEVFL以及pBAC-TGEVΔClaI，pBAC-TGEVClaI在DH10B细菌中传200代，通过酶切图谱对质粒进行鉴定。
结果发现pBAC-TGEVΔClaI和pBAC-TGEV ClaI非常稳定传代，而pBAC-TGEVFL在80代后不稳定，酶切图谱发生改变。
如图B所示，用EcoR I和Xho I进行酶切鉴定，得到A-J的条带，其中C片段太小，254bp，DNA电泳看不到。
A, 4,458 bp; B, 3,759 bp; C, 254 bp; D, 2,372 bp; E, 515 bp; F, 2,834 bp; G, 6,671 bp; H, 2,069 bp; I, 7,421 bp; J, 6,357 bp.  

如图A中，在80代后，全长cDNA克隆的酶切图谱出现改变，多出一条1.2kb左右的条带，同时缺少了一个0.5kb的条带。
每一代的菌涂布在培养皿上进行培养，长出大小不同的菌落，其中小菌落能得到正确的cDNA克隆，大菌落中的质粒则发生重排。
随着代次的增加，大菌落的比例越来越大。发现大菌落中的质粒中出现一些插入片段，多为0.7-2.6Kb，发生在ORF 1a读码框中，对其中一个0.7kb的小片段进行测序。
插入序列是一个类似转座子的基因，包括两个反转序列ITR（23bp),这个序列随机插入到基因组中，产生一个9bp的重复序列。 (Fig. 2C).

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插入内含子后增加TGEV全长感染性克隆的稳定性
DH10B大克隆中TGEV全长cDNA克隆中常被插入外源序列的位置在基因组中的第7500-11000位置，在ORF 1a基因处。
因此选择这个位置插入一段外源基因，如内含子序列。含有内含子的全长克隆在核内完成内含子的切割和连接，RNA再转入胞浆中，ORF得以保留正确的框架，具有感染性。
内含子选择了一段来自pRL-CMV，长133nt的合成基因。 (Promega)
利用人类DNA序列中剪接位点预测程序(HSPL)对插入位点的理论剪切概率进行计算。
其中，8826, 9466, 和9596位点具有很强的剪切概率。内含子的插入通过重叠延申PCR构建，引物序列如表所示

利用Cla I将插入内含子ClaI4417-ClaI9615片段插入到质粒pBAC-TGEVΔClaI.
构建得到的质粒分别命名为pBAC-TGEVFL-INT8826, pBAC-TGEVFL-INT9466,pBAC-TGEVFL-INT9596

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TGEV的cDNA克隆在不同的代次进行酶切鉴定比较(Fig.3B). 8826插入内含子的克隆至少保持80代的稳定性，但是在80代后插入了一段1,329 bp的插入序列(IS10R)。
而在9466或者9596位点插入内含子的cDNA全长克隆，在200代仍然保持稳定性。
对几个质粒的8500-10500位进行测序，确定质粒没有发生核苷酸突变，小片段插入或者缺失等等。

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将pBAC-TGEVFL-INT9466 ，pBAC-TGEVFL-INT9596, pBAC-TGEVFL转染BHK-pAPN细胞中。
BHK-pAPN是能持续表达TGEV受体(猪氨肽酶-N)的BHK细胞，和ST细胞相比较，转染效率增加10倍。
转染后6小时，将BHK-pAPN细胞消化后，加到ST细胞上增加TGEV复制能力。转染后72小时，从0代得到的病毒上清用于感染ST细胞，每24小时重复一次，前后4次。
在1-4代都能观察到细胞病变。说明插入内含子的全长cDNA克隆能得到拯救病毒。
在pBAC-TGEVFL-INT9596中引入的一个位点突变C9584T出现在拯救病毒中，说明得到的拯救病毒不是来自污染。
另外在拯救病毒中不再出现内含子序列，说明已经被精准移除掉，保留了野生株的基因组序列。