Dengue Virus Envelope Dimer Epitope Monoclonal Antibodies Isolated from Dengu...

潇湘妃

Dengue Virus Envelope Dimer Epitope Monoclonal Antibodies Isolated from Dengue Patients Are Protective against Zika Virus

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摘要：寨卡病毒2013年传播至巴西，引起数千例严重的婴儿畸形和神经性疾病。
黄热病毒抗体具有保护性，可产生终身性免疫。
但是黄热病毒抗体之间的交叉保护性会混淆诊断，ADE效应导致病情加重也时有发生。
南美洲由于DENV的流行，已在群体中产生的免疫对于限制该地区ZIKV的传播和流行有一定的意义。

本研究探索了DENV患者体内单抗和免疫血清对于ZIKV流行株的中和作用。

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背景部分 摘选
寨卡病毒属于黄热病毒科，黄热病毒属的虫媒病毒。
黄热病毒感染机体后，有的出现神经毒性（JEV或者WNV），有的是出现出血热（DENV或者YFV）
寨卡病毒为自限性发热疾病，包括轻度发热，皮疹，关节疼，或者结膜炎等，对公众健康没有太过严重的威胁。
2015年在美国有一次爆发流行，随之而来的研究发现寨卡感染和胎儿畸形有关，尤其严重的是小头畸形。
WHO官宣寨卡感染会引起格林-巴尔综合征和脑膜脑炎病例的增加。寨卡病毒和DEN同属黄热病毒属，60%基因组有同源性，流行区域也有交叉。
目前，很多登革疫苗处于II期和III期临床实验阶段，包括一个四价疫苗。
在寨卡病毒流行的区域，部分人群已经产生DEN抗体，这样干扰了对诊断寨卡感染的判断。

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细胞，病毒，血清，抗体等实验材料
C6/36细胞用于所有病毒的培养增殖，32℃培养。
Vero-81细胞
U937-DC-SIGN细胞
ZIKAH/PF/2013病毒/ ZIKV PRVABC59病毒
用于DENV多抗中和实验的病毒株包括DENV-1 WestPac74, DENV-2 S-16803, DENV-3 CH-53489, DENV-4 TVP-376，病毒为天然野生株
用于DENV单抗中和实验的病毒株包括DENV-1 WestPac74, DENV-2 S-16803, DENV-3 UNC3001, DENV-4 SriLanka 92A，病毒来源于感染性克隆株。

抗体来源：
收集已鉴定的DENV自然感染者或者疫苗接种者免疫血清和血浆
杂交瘤纯化出的1M7和1N5抗体。
根据已有公布的序列合成的1F4, 2D22, 5J7, 5H2, 4G2, EDE1 C8, EDE1 C10, EDE2 B7单抗。

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体外中和实验：
1 人血清或者单抗进行3倍稀释，稀释液加减量的胎牛血清（2%)，2 mMCaCl2和MgCl2。
2  取能感染15% U937+DC-SIGN细胞的病毒量，分别和一定体积等倍稀释的血清或多抗混匀。
3. 将病毒-抗体混合物加入无菌的96孔细胞板中，37℃，孵育45分钟。
4. 每孔加入5*10^4个细胞，37℃，感染两小时。
5. 补加培养液至总体积为200ul，37℃，24小时过夜培养。
6. 取出96孔板，弃上清，多聚甲醛固定，破膜，鼠血清封闭，Alexa Fluor 488-标记的4G2抗体进行染色。
7. 洗去未结合的抗体，用 加2% 胎牛血清Hanks’ 液体重悬细胞。
8. Guava easyCyte 5HT流式细胞仪(Millipore) 计数。

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体外中和实验：

1. 10倍稀释多克隆抗体，每个稀释度的多抗样品和150个ffu的病毒混合。
2. 37℃，孵育1小时。
3. 将病毒-抗体混合物加入铺满VERO-81细胞的96孔细胞板中，37℃，感染1小时。
4. 加入含2%胎牛血清和1%羧甲基纤维素的Opti-MEM。
5. 37℃培养2天
6. 多聚甲醛固定，破膜，山羊血清封闭，加4G2抗体，加HRP标记的抗小鼠二抗。
7.  加TrueBlue peroxidase substrate (KPL, Gaithersburg, MD)底物显色。

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结合实验
1. 用Microlon 600 96-well plates (VWR, Radnor, PA，应该就是高结合力的ELISA板) 包被抗体4G2或者2H2，4℃过夜。
2. TBS (加入 0.2% 吐温) 洗去未结合的抗体。
3. 37℃，封闭液TBS （加入0.05%吐温) 封闭1个小时。
4. 封闭液稀释病毒，浓度大概为 at a concentration sufficient to result in approximately equal reactivity with a human cross-reactive control serum （？）
5. 病毒液加入96孔板，37℃，结合1个小时。
6. 清洗板子，加AP-标记的山羊抗人IgG抗体，37℃，作用1个小时。
7. 清洗板子，加底物SigmaFast p-nitrophenyl phosphate tablets (Sigma, St.Louis, MO)。
8. 405nm处读数。

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寨卡病毒和人，非人灵长类，鼠多抗的中和活性实验。
为了解DENV和ZIKV之间的抗体交叉反应和功能，用已知特性的多种人源和鼠源DEN单抗和两株寨卡病毒(H/PF/2013和PRVABC59) 进行结合实验（binding）以及中和活性（neutralization）实验。
（1）和预期一致，来自人源和非人灵长类的多抗和DENV型特异性抗体（1F4，2D22，5J7，5H2）能和各型DEN病毒产生很强的中和反应，而和寨卡病毒结合能力很弱，（EC50值越低说明结合活性越好）。
（2）能和2-3种不同型的登革发生交叉反应的多抗 (4G2, 1N5），和两株寨卡病毒的结合能力也是很弱。
（3）和四型登革都有交叉反应的广谱抗体（EDE1 C8，EDE1 C10，EDE2 B7，1M7)，其中MAbs EDE1 C8和EDE1 C10对两株寨卡病毒有很强的中和活性，能够有效中和感染表达DC-SIGN U937细胞的寨卡病毒。而比较有意思的是EDE2 B7 抗体和四型登革都能有效结合，却不能中和寨卡病毒。此外，1M7也和寨卡病毒没有结合能力。

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MAbs EDE1 C8和EDE1 C10对两株寨卡病毒有很强的中和活性，能够有效中和感染表达DC-SIGN U937细胞的寨卡病毒。
用两株寨卡病毒感染VERO细胞，检测MAbs EDE1 C8和EDE1 C10检测中和活性，得到同样的结果。

用ZIKV H/PF/2013病毒和3株抗体进行病毒结合实验，结果显示C8结合能力最强，B7结合能力弱

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动物实验：
5周龄的type I/II IFN-r 敲除基因C57BL/6小鼠。
感染前1天以及感染后第9天，给对照组小鼠（2只）注射生理盐水，实验组注射10ug EDE1 C10抗体，腹腔注射，注射体积为100ul。
感染小鼠的病毒剂量为100ffuZIKV H/PF/2013，10ul，左后掌皮下注射。
每日监测体重和有无发病症状，一共观察14天。