0011-0021 杂交瘤技术制备单克隆抗体实验流程

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1975年Kohler和Milstein建立了杂交瘤制备单抗技术，经绵羊红细胞（SRBC）免疫的小鼠脾细胞和小鼠的骨髓瘤细胞融合，创立了第一个B细胞杂交瘤细胞株，获得了抗SRBC的单克隆抗体。杂交瘤细胞克隆是由一个产生抗体的B淋巴细胞与一个骨髓瘤细胞融合，经过无性繁殖产生的细胞群，其分泌的抗体都是针对某一抗原决定簇的，特异性强，且具有相同的免疫球蛋白类型和亲和力，所以称之为单克隆抗体，简称单抗。
单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次革命，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。因此说单抗技术是免疫学，乃至医学史上的一个里程碑。

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杂交瘤技术制备单抗的主要步骤包括：动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选与单抗检测、杂交瘤细胞的克隆化、冻存、单抗的鉴定等，下图概括了淋巴细胞杂交瘤技术研制单抗的主要过程。

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STEP 1:  细胞融合技术制备杂交瘤淋巴细胞
杂交瘤细胞的融合
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细胞融合时可以出现：脾细胞和骨髓瘤细胞的融合，脾细胞之间的融合，骨髓瘤之间的融合，此外还有大量的未融合细胞。

如何除去大量未融合及自身融合的细胞呢？

用HAT进行筛选。

HAT培养基含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤（A)、胸腺啶脱氧核苷( T)。

其对融合细胞进行选择性的原理是：

HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）和TK(腺苷激酶)是细胞合成DNA和RNA旁路途径上两个重要的酶。如果缺乏任意一种，在正常途径受阻的情况下，细胞将不能利用旁路途径合成DNA而死亡。

骨髓瘤细胞多为HGPRT缺陷株，或是TK缺陷株。HAT中的A为氨基喋呤，是一种正常途径的阻断剂，H和T分别是次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷，它们分别是HGPRT和TK的底物，具备HGPRT和TK的细胞在正常途径受阻时，可利用H和T依靠旁路途径合成DNA和RNA继续生存。在杂交瘤制备中，致敏的B淋巴细胞含有HGPRT和TK，它与骨髓瘤细胞融合，可以弥补骨髓瘤细胞缺陷，因此形成的杂交瘤细胞能在HAT选择性培养基中长期存活，而未能杂交的细胞全部死亡。

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STEP 2: 杂交瘤细胞的筛选和抗体检测
杂交瘤细胞在融合后2周左右即可筛选，即把分泌所需抗体的杂交瘤孔从众多的孔中选出来，通常也称为抗体检测。抗体检测的方法很多，作为杂交瘤筛选的抗体检测方法必须具有快速、准备、简便，便于一次处理大量样品等特点。因为往往有几百个样品需要在短短几个小时就报告结果，以便决定杂交瘤细胞的取舍。
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STEP 3： 杂交瘤细胞的克隆化--有限稀释法
克隆化培养即单细胞培养技术，指使单个细胞无性繁殖从而获得该细胞集合体的整个培养过程。用有限稀释法进行杂交瘤细胞克隆化培养，可以及时确定阳性杂交瘤细胞株，同时淘汰因发生染色体丢失或抗体的轻、重链基因分离而出现无抗体分泌阴性细胞株。
一般杂交瘤细胞需经过2-3次反复克隆后，才能达到100%细胞阳性率。有限稀释法也适用于一般细胞培养中的细胞纯化、突变细胞株的选择、识别和分离。

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STEP 3： 杂交瘤细胞的克隆化--软琼脂克隆形成实验
在进行杂交瘤细胞克隆纯化时，除有限稀释外，还可以用软琼脂克隆形成实验
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STEP 4： 腹水法大量制备单抗
杂交瘤细胞、骨髓瘤细胞或其他细胞在液氮中保存，若无意外情况时，可保存数年至数十年。复苏时融解细胞速度要快，使之迅速通过最易受损的-5℃-0℃，以防细胞内形成冰晶引起细胞死亡。杂交瘤细胞克隆化建系及冻存后，可以采用体内或者体外法进行大规模制备单抗，体外法是将杂交瘤细胞用无血清培养液进行体外培养，使其大量生长直至死亡，从上清中获取单抗，此方法得到的抗体量比较少，所以目前大量制备单抗常用的方法是将杂交瘤细胞接种于同系小鼠腹腔，制备腹水或者血清。

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STEP 5: 腹水型单抗的纯化
抗体纯化是指从生物原料如抗血清, 单克隆杂交瘤细胞培养上清, 小鼠腹水等中通过一定的物理或化学方法获取具有生物活性的高纯度目的抗体的过程。杂交瘤产生的免疫球蛋白主要是IgG和IgM，究竟是哪种为主，则决定于抗原的免疫程序。免疫一次，且3天后就取脾，多为产生IgM的B淋巴细胞。免疫多次的多为IgG。实验室常规杂交瘤技术从小鼠腹水中纯化抗体，基本以IgG为主。
蛋白的纯化工作非常复杂, 既要保证纯度, 又必须保持其生物活性。较为常规的抗体纯化方法有饱和硫酸铵沉淀（SAS）, 聚乙二醇沉淀, 辛酸-硫酸铵，离子交换, 分子筛, 亲和层析, MEP层析, Protein A/G，免疫磁珠等方法。每种蛋白质的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异,按纯化后蛋白的需求不同采用相应的纯化方法。目前，对于腹水型单抗的纯化普遍采用的方法是将硫酸铵沉淀与亲和层析法结合起来，即先采用硫酸铵盐析法粗提，再经亲和层析得到较纯的IgG。
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STEP 6: 单抗鉴定--杂交瘤细胞的染色体计数分析
杂交瘤细胞在培养过程中，编码抗体的染色体容易丢失，因此在杂交瘤及单抗研究中，细胞遗传分析技术在鉴定杂交瘤、观察细胞株突变、探索抗体特性等方面均具有重要价值。正常鼠的脾细胞染色体数为40，小鼠骨髓瘤细胞染色体：SP2/0细胞为62—68，NS-1为54～64条。杂交瘤细胞的染色体数目接近两亲本细胞染色体数目的总和，染色体数目多且较集中的杂交瘤细胞分泌高效价的抗体。
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