Construction and characterization of a replication-competent human adenovirus...

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通过同源重组的方法构建pBRAd⊿E3GFP

RsrII酶单切质粒HAdV-3感染性克隆pBRAd，线性化后用小牛碱性磷酸酶去磷。

EcoR V和Not I双切质粒pSKE3LCMV-Egfp-SV40R，回收E3LCMV-Egfp-SV40R线性化片段。

两个处理后的线性化片段混合后转化E. coli BJ5183

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对新构建的重组质粒进行双重PCR扩增鉴定。从40个随机挑取的菌落中得到10个阳性克隆。

第一对引物（扩增产物长727bp）：

GFP1: 5_ CGCCACCATGGTGAGCAA 3_;

GFP2: 5_TTACTTGTACAGCTCGTCCATGC 3’

第二对引物（扩增产物长533bp）：

Ad11134F:5_ CGAGGAGCCAGAGGAGA3_;

Ad11666R: 5_ TGCGAGCGTAGTATTTGC 3_

最终构建的质粒电子序列见附件：pBRAd⊿E3GFP。

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用Vector NTI 10.3.0 软件分析感染性克隆质粒pBRADv和带报告基因eGFP的表达载体pBRAd⊿E3GFP
实际酶切图谱和软件分析结果基本一致

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IFA间接免疫荧光

第五代重组病毒rHADv-3感染Hep-2细胞后第三天，常光下能观察到CPE（下图A），IFA能检测到腺病毒六邻体蛋白的表达，荧光镜下可观察到绿色荧光。

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重组病毒感染Hep-2细胞后三天，电镜下可以看到Hep-2细胞中的（A）rHAdV-3病毒颗粒(20,000×).  (B) rAd_E3GFP (21,000×)，病毒颗粒直径为70-90nm。

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酶切（AsiSI）质粒pBRAd⊿E3GFP，能得到线性化的带有EGFP报告基因，E3区缺陷的HAdV基因组，转染HEp-2细胞 。

（A）24小时即能观察到EGFP的表达。

（B）转染后96小时，收获细胞，反复冻融三次，感染HEp-2细胞，96小时后，收集新的一代病毒。传至第五代时，可以看到非常强的EGFP表达荧光信号。

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用实时定量PCR评价rHAdV-3，rAd_E3GFP，和野生型病毒的DNA复制能力

HEp-2在24孔板子中孵育，每孔接种10^7拷贝数病毒。

病毒感染细胞后 12 h, 24 h, 36 h，48 h，60 h, 72 h，检测病毒的拷贝数，Origin 7.5 软件分析实验结果，Adeno-X rapid titer kit (Clontech)估算病毒的滴度(IFU)/ml

rHAdV-3 重组病毒和野生株GZ1 strain复制能力相当，略高于rAd-E3GFP。

可见E3基因缺失对于腺病毒的复制没有太显著的影响。72小时收获的病毒HAdV-3，rHAdV-3 ，rAd_E3GFP 滴度分别达到 8×10^10，7.2×10^10，6.4×10^10 (IFU)/ml。

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Western blot 检测不同代次的重组rHAdV-3病毒

用兔源腺病毒六邻体蛋白的多抗检测不同代次的HAdV-3重组病毒感染细胞提取物，1-5分别为1-5代次的病毒，1代检测不到，代次越高信号越强。

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30只小鼠随机分为5组

① 肌肉注射 rAd_E3GFP，10^10copies/ml, 0.2 ml

② 鼻饲rAd_E3GFP，10^11 copies/ml, 0.02 ml

③ 灌胃rAd_E3GFP，10^10 copies/ml, 0.2 ml

④ 肌肉注射野生型HAdV-3 GZ1，10^10copies/ml, 0.2 ml

⑤ 肌肉注射PBS，1010copies/ml, 0.2 ml

每两周加强免疫一次。

头次免疫后第42天，取血分离血清，用于血清学中和抗体实验。

用rAd_E3GFP按不同途径（肌肉，鼻饲，胃灌）接种小鼠后的抗血清检测eGFP蛋白，均能产生阳性信号，其中鼻饲组抗体滴度最高，而用野生型病毒感染后的小鼠血清进行WB实验则检测不到EGFP蛋白。

中和抗体实验结果，其中肌肉注射组中和活性最强。

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讨论区摘要
HADv-3基因组长35kb，感染性克隆pBRADv的成功构建为疫苗的研制，构建用于免疫和基因治疗的基因递送载体，以及为机制研究建立基础。
在HADv-3基因组E3区去掉一段长3164bp（nt27739-30900），保留了E3基因前后662和218bp的两端序列，对于VIII和fiber蛋白结构没有影响，不影响病毒的复制和包装，可插入外源基因理论值约4.8kb。
多年来，HAdV-5-载体（C型）在重组疫苗和基因治疗载体的应用中发挥重要作用。
C型和B型腺病毒的一个主要区别在于识别的细胞上受体有所不同，HAdV3病毒可能会克服宿主的限制，成为替代HAdV5的新型基因转运载体。
另一方面，由于我国之前鲜有HAdV3感染，人体内缺乏相应的中和抗体，所以HAdV3作为载体可以避免人体内已产生免疫力，干扰基因治疗。
HAdV-B型致病源具有地域性，全球性传播的特点，容易引起呼吸系统疾病，现在将来都急需便宜，有效的疫苗进行预防。
1970年代，在美国和加拿大里，军队人群中使用腺病毒-4/-7的肠溶口服疫苗成功控制了ARD的发生发展。近二十年来，腺病毒相关的ARD和肺炎发病率也得以显著降低。