【读书笔记】噬菌体展示技术--通用实验指南

黄帮主

噬菌体展示技术存在的缺陷：
大肠杆菌宿主细胞用辅助噬菌体超感染，通过包装带有外源蛋白-pIII融合基因以及所有的噬菌体结构蛋白包括野生型pIII蛋白，来生产重组噬菌体。
目前的展示系统普遍存在展示效率低下的问题，比如抗体库中展示ScFv效率仅仅为1-3%。
解决的方式可以有：
将辅助噬菌体pIII基因敲除或者缺陷，减少野生型pIII的掺入。制备包装菌株。

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噬菌体表面的外壳蛋是常用的展示分子，而其他外壳蛋白gIII，pVIII，pVII等比较适合展示小分子肽。
传统的gIII 系统也存在一些问题，主要是由于gIII 蛋白分子量较大，与外源蛋白融合表达时会影响细菌生长状态，有时会导致某些克隆的丢失，使抗体库实际库容量减小，并且在抗体库筛选中有时得到一些非特异性结合克隆。抗体或其他大分子蛋白与gIII融合时，会降低周围gIII蛋白的感染能力，从而影响筛选后阳性克隆的回收，导致阳性克隆丢失。


通过不同机制构建的辅助噬菌体主要有两大类：
1.含全长gIII的辅助噬菌体；
包括M13K07K07、R408和VCSM13K07，广泛使用。
比如M13K07K07带有一个质粒复制起点，卡那霉素抗性基因，以及G6125T的突变基因II。当M13K07超感染含有噬粒的菌株时，噬粒突变的gII产物将优先作用于噬菌粒载体上的复制起始区，因此噬粒产生的链比辅助噬菌体更多，感染细胞产生的病毒颗粒有两种，其中来源于噬粒的单链DNA占优势。
2.gIII删除或缺陷的辅助噬菌体：
包括M13K07MDD3.2、R408D3、VCSM13K07D3是通过删除M13K07K07、R408和VCSM13K07的gIII而得到。

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使用寡核苷酸定向诱变构建噬菌体展示文库
文库的多样性和性质是建立高度多样化的噬菌体展示文库能有效保障筛选工作
多样性保证在10^10以上
可以用随机突变或者定点突变的方法构建文库，定点突变可以用双链盒式突变和单链寡核苷酸定向诱变的方法来实现。

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第六章：利用噬菌体肽库为受体寻找配体
成功的案例有：细胞因子受体激活剂和拮抗剂，蛋白酶抑制剂，离子门通道受体的配体
受体和配体的相互作用，高亲和力是筛选到受体的相应配体的前提。
用噬菌体肽库筛选配体的步骤：
1 利用pVIII蛋白展示载体构建一个随机肽库，初步筛选结合力相对较弱的配体，此步实验的目标是能获得特异性结合靶蛋白的配体家族。2 利用次级文库，通过对文库进行针对亲和力提高的系列突变，筛选得到高亲和力的配体。

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如何构建肽展示噬菌体库
以pBV5(4821BP)为例。
这个载体带有VIII噬菌体蛋白，随机肽段和VIII蛋白融合，受可诱导的阿拉伯糖启动子调控。另一种系统是质粒上的肽段展示系统“peptides on plasmids”
是将肽段片段融合表达再大肠杆菌乳糖抑制蛋白的C端。
这两个系统均能进行多价展示，在前几轮筛选中这种多价结合的亲和效应非常重要。

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获得先导肽后，开始使用低价展示的次级库进行筛选，得到亲和力更高的配体。
次级肽库是在初级肽库的基础上进行构建。
一种是将变异的肽段融合到基因III的N端。
另一种是基于乳糖操纵子的系统，叫做冠状二聚体系统。
这两个系统均能优化先导肽的。
其中冠状二聚体系统更为有效。

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构建pVIII噬菌粒随机肽库
第一步，准备载体，大量扩增获得。噬菌粒质粒可以通过提质粒试剂盒进行纯化，方案成熟。
第二步，插入片段的准备

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固相筛选
适用性好，高通量筛选，是目前最常用也是最有效的筛选方法。
固相筛选将纯化的抗原包被再酶联板，芯片，免疫管等固相介质上，或者将其交联形成层析柱来进行筛选。
由于一些抗原固定后表位容易发生改变，筛选得到的抗体不识别天然抗原。
间接包被法可以选择包被另一个针对该靶抗原的抗体来解决。

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液相筛选
液相筛选是多采用抗原和生物素相连，再将其固定在液相上，在链亲和素磁珠上借助磁场作用进行筛选。
该方法克服了固相筛选包被抗原时构象改变问题。
筛选效率较高，噬菌体与抗原接触的几率增大，可以有效分离拷贝数较少和亲和力较低的抗体克隆。

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细胞筛选
利用单层生长，或悬浮，或贴壁的完整细胞对抗体库进行直接筛选，可以获得细胞表面特定的标志物的特异性抗体。
该方法特别适合用于糖蛋白或脂蛋白等难以表达或纯化的膜抗原。
主要的筛检策略是消减法，竞争筛选法，内化筛选法。