Molecular and Biological Characterization of Human Monoclonal Antibodies...

潇湘妃

构建表达SARS其它毒株的一系列S318-510蛋白
除了FM1株外，其它毒株的S蛋白基因也进行了表达。用于鉴定抗体的特异性，是否和其他毒株结合。

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ELISA鉴定抗体结合抗原.
双夹心法检测。
包被anti-myc抗体，加带myc标签的各种S抗原和N抗原。加表达的全抗/HRP-抗his二抗，加HRP-抗人IGG二抗，OPD显色。

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结合N蛋白的抗体鉴定
之前的免疫沉降实验显示SARS-CoV病毒蛋白大小介于46-180kDa。
本研究中合成的全抗经ELISA检测，抗体CR3009和CR3018和N蛋白特异性结合。
其中，CR3009和N蛋白亲合力比CR3018更强。

C图为竞争ELISA实验结果，可以看到两株抗体之间识别表位不同，不产生竞争效应。

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应用PEPSCAN分析研究CR3009和CR3018抗体识别的N蛋白抗原表位用两套（每套2740个短肽，分别为线性和环状两种）重叠15短肽进行抗体的表位筛选。
结果CR3009未能显示出具体和哪个肽结合，说明可能识别的是空间表位。
下图是CR3018结果，显示从线性肽段GPQSNQRSAPRITFG，环状PQSNQRSAPRIT开始结合，终止于RSAPRITFGGPTDST,
共同识别的肽段为RSAPRITFG。

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免疫电镜技术检测抗体和N蛋白的结合
感染SARS病毒的vero细胞，加CR3009和CR3018抗体以及对照抗体，二抗为抗人-igG-5nm的金标颗粒。
如图可见，A和B图中清晰可见金标颗粒，说明两种抗体均能和病毒颗粒蛋白结合。

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结合S蛋白的抗体鉴定
首先采用流式细胞术，用表达S蛋白的细胞和抗体孵育结合，显示CR3006, CR3013, CR3014, 和CR3015能特异性结合S蛋白瞬转293T细胞。
进一步定位这些抗体在S蛋白上的结合位点，检测抗体和1-565位S蛋白的结合，以及和RBD区（即ACE2受体结合区域，318-510位）其中，CR3015和截断蛋白不结合，其它三个蛋白和截断蛋白都结合。



图B显示几个抗体中CR3014亲合力最高。
在SCFV/PHAGE阶段，CR3013和CR3014抗体显示和sars病毒有结合竞争。
分析序列可见两株抗体高度同源，进一步用竞争ELISA实验证实，蛋白用S565截断蛋白。
CR3006和所有抗体都有竞争抑制
CR3013和自身抗体，CR3014竞争抑制
CR3014只和自身为标记抗体产生竞争抑制。
说明这三个抗体识别同一个或者有重叠的表位，并且三株抗体亲和力各不相同。

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进一步评价CR3006, CR3013，CR3014抗体是否和其他SARS-CoV毒株结合。
对114株SARS-COV毒株S蛋白的318-510位进行分析，共有8种不同的序列，见表1，和FM1株的S蛋白不尽相同。

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将这个8个序列的318-510位蛋白进行表达，分别和CR3006, CR3013，CR3014结合。
如图7，CR3006和突变蛋白5，8号不结合，说明Y442，F360, L472, D480, T487影响CR3006识别表位。

CR3013和CR3014能识别所有S318-510突变株，不过和六号结合力稍弱。为了进一步研究CR3014识别表位，用抗-HIS6抗体对蛋白进行标化对照，如图7b，和其他蛋白相比，CR3014和6号蛋白结合能力的确较弱。
Pepscan分析抗S的几株抗体，未检测到任何线性S蛋白表位
抗体CR3001和CR3002没有显示出和N或者S蛋白结合。
用2740个线性/环状多肽进行Pepscan分析也未见任何结合。说明这两个抗体可能是和空间表位或者是其他pepscan未覆盖到的蛋白结合。

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抗体抑制S565和VERO结合实验
流式细胞术检测CR3014抗体对S1结构域和VERO细胞上ACE2受体结合的干扰情况。
①
S蛋白转染的293T细胞和浓度为10ng/UL的人IgG共同在冰上孵育1小时。
清洗细胞三次后，和生物素标记的山羊抗人IgG共同孵育45分钟。
加链霉亲和素标记的藻红蛋白孵育10min。
FACS进行分析。
②
表达ACE2的vero细胞和饱和浓度的S565蛋白进行孵育。
同时加入0.5uM的IgG抗体一起孵育，或者不加抗体作为对照。
清洗细胞三次后，加生物素标记的抗-myc抗体，加链霉亲和素标记的藻红蛋白孵育
FACS进行分析。

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三株抗体CR3014（抗S抗体），CR3018(抗N抗体）， CR3006（抗S抗体）。

如图，
CR3014能完全抑制S565和VERO细胞结合。
CR3018不能抑制
CR3006部分抑制。