ELISA整理资料

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包被
固相的抗原或抗体称为免疫吸附剂。将抗原或抗体固相化的过程称为包被（coating）。
1. 抗原或抗体溶于缓冲液（最常用的为pH9.6的碳酸缓冲液） 。
2. 加于ELISA板孔中在4℃过夜。
3. 包被后再用1％～5％牛血清白蛋白包被一次，可以消除这种干扰。这一过程称为封闭（blocking）。（封闭有利于降低本底值。）
4. 包被好的ELISA板在低温可放置一段时间而不失去其免疫活性。

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酶和底物
1. 纯度高、催化反应的转化率高、专一性强、性质稳定、来源丰富、价格不贵。
2. 制备成的酶标抗体或抗原性质稳定，继续保留着它的活性部分和催化能力。
3. 受检标本中最好不存在与标记酶相同的酶。
4. 相应底物应易于制备和保存，价格低廉。
5. 有色产物易于测定，光吸收高。

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ELISA常用酶：
① 辣根过氧化酶（HRP）
1. HRP在蔬菜作物辣根中含量很高。
2. 是一种糖蛋白，含糖量约18％；分子量为44kD。
3. 是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成的一种卟啉蛋白质。
4. 主酶为无色糖蛋白，在275nm波长处有最高吸收峰；辅基是深棕色的含铁卟啉环，在403nm波长处有最高吸收峰。

② 碱性磷酸酶（AP）1.大肠杆菌提取的AP分子量为80kD，酶作用的最适pH为8.0 。
2.小牛肠粘膜提取的AP分子量为100kD，最适pH为9.6。
3. 硝基苯磷酸酯（p-nitrophenylphosphate，p-NPP）作为底物。它可制成片状试剂，使用方便。
5. 产物为黄色的对硝基酚，在405nm有吸收峰。用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一段时间。

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常用的酶反应底物
1. OPD（邻苯二胺）为在ELISA中应用最多的底物，灵敏度高，比色方便。缺点是配成应用液后稳定性差，而且具有致异变性。
2. TMB（四甲基联苯胺）没有OPD的缺点。TMB经酶作用后由无色变蓝色，目测对比鲜明；加酸停止酶反应后变黄色，可在比色计中定量；因此应用日见增多。
3. ABTS（2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐），虽然灵敏度不如OPD和TMB，但空白值很低。

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HRP的纯度用RZ（ReinheitZahl，意为纯度数）表示，是403nm的吸光度与280nm的吸光度之比，高纯度的HRP的RZ≥3.0。应注意的是酶变性后，RZ可不变而活力降低，故重用酶制剂时更重要的指标为活力。
酶活力以单位表示：
1min将1μmol的底物转化为产物的酶量为1个单位。

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HRP与AP比较
1. AP系统的其敏感性一般高于HRP系统，空白值也较低。
2. 由于AP较难得到高纯度制剂，稳定性较HRP低。
3. AP价格较HRP高。
4. 制备酶结合物时AP得率较HRP低等。
5. 国内在ELISA中一般均采用HRP。

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工作浓度
在ELISA测定中，应对包被抗原或抗体的浓度和酶标抗原或抗体的浓度予以选择，以达到最合适的测定条件和节省测定费用。
（一）间接法测抗体
1．酶标抗抗体工作浓度的选择
（1）用100ng/ml人IgG进行包被，洗涤。
（2）将酶标抗人IgG用稀释液作一系列稀释后分别加入已包被的孔中，保温、洗涤。
（3）加底物显色。加酸终止反应后，读取吸光度（A），绘制曲线。读取A值在1.0时的酶标抗体稀释度，作为酶标抗体的工作浓度。该酶标抗人IgG的工作浓度应为1/1600。

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棋盘滴定法选择包被抗原工作浓度:
（1）用包被液将抗原作一系列稀释后进行包被，洗涤。
（2）将强阳性参考血清、弱阳性参考血清和阴性参考血清用稀释液作1:100稀释，加样，保温，洗涤。
（3）加按工作浓度稀释的酶标抗人IgG抗体，保温，洗涤。
（4）加底物显色。加酸终止反应后读取A值。
（5）选择强阳性参考血清的A值为0.8左右、阴性参考血清的A值小于0.1的包被抗的的稀释度作为工作浓度。

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夹心法ELISA中可用棋盘滴定法同时选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度：
1. 抗体免疫球蛋白用包被缓冲液稀释至蛋白浓度为10、1和0.1μg/ml，分别在ELISA板上进行包被，每一浓度包括三个纵行，洗涤。
2. 在一个横行各包被孔中加入强阳性抗原液，另一横行加入弱阳性抗原液，第三横行加入阴性对照液，保温，洗涤。
3. 将酶标抗体用稀释液稀释成三个浓度，例如1:1000、1:5000和1:25000。分别加入每一包被浓度的一个纵行中，保温，洗涤。
4. 加底物显色。加酸终止反应后，读取A值。
5. 以强阳性抗原的A值在0.8左右、阴性参考的A值小于0.1的条件作最适条件，据此选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度。
为了进一步节省试剂，可以此选择的浓度为基点，缩小间距再做进一步的棋盘滴定。

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测定方法
n 制定测定方案
n 正确制备试剂
n 包被缓冲液、洗涤液、标本稀释液、结合物稀释液、
底物工作液和酶反应终止液等，都要小心配制。
n 蒸馏水最好使用新鲜重蒸馏的。不合格的蒸馏水可使
空白值升高。