Development of Anti-Yersinia pestis Human Antibodies with Features Required ...

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基于流式细胞术的抗体鉴定？？
细胞洗两次，用Accuri Plus6流式细胞术(BD Biosciences)。未标记细胞作为对照设置流式细胞术参数。

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侧流法LFA检测F1V抗原？？
1抗体胶体金偶联物
流式细胞仪分析与分型
分子检测:全基因组扩增和PCR
混合细菌群落分析:
荧光细胞(怀疑是鼠疫菌)和非荧光细胞(其他细菌种类)的门控和分类，用于后续的全基因组扩增和PCR检测.扩增细菌16s RNA

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αF1 IgG对人上皮细胞的影响
上呼吸道人支气管上皮细胞(HBTECs)和下呼吸道人小气道上皮细胞(HSAECs),


放射性标记抗体对鼠疫杆菌的影响
αF1Ig 2和αF1Ig 8与DTPA的偶联

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αF1Ig 2与αF1Ig 8与抗f1 m252抗体

抗F1 M252序列和αF1Ig 2或αF2Ig 8的可变区被导入到可从http：//www.ebi.ac.uk获得。

m252（68. Xiao X, Zhu Z, Dankmeyer JL, et al. Human anti-plague monoclonal  antibodies protect mice from Yersinia pestis in a bubonic plague model. PLoS One. 2010;5(10):e13047doi:10.1371/journal.pone.0013047）
αF1Ig 2和8与之前描述的人抗F1抗体m25268的比较表明，这些抗体对F1有相似的亲和力(尽管它们的动力学研究方法不同)，对靶点有较高的特异性。我们不能比较产量或稳定性，因为这些特征没有m252的报道。序列比对显示相似性非常低(补充图S11)，这支持了我们的抗体的独特性，支持我们的抗体的独特性以及我们的两个新型人类正交F1靶向IgG对拉动具有鼠疫诊断和治疗潜力的抗体的贡献。

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结果
通过流式细胞术评估了7组预先选择的人源抗F1单链抗体(ScFvs58)用重组F1抗原对酵母展示抗体的识别能力。酵母展示蛋白的表达和活性可作为正确折叠的指标。 7个单链抗体中有6个表达良好并具有活性，因此用ATUM(www.atum.bio)将其转化为全长IgG1，命名为aF1-IgGX(其中X表示特定克隆的数量)。产量高于平均水平(>0.1 mg/mL培养物)，其中αF1 Ig 8产量尤为显著(0.6 mg/mL)。
鼠疫耶尔森氏菌A1122.71荚膜抗原F1在37°C生长期间在鼠疫耶尔森氏菌表面表达良好的特异性进行了测试，但在23°C时不表达。因此，在本文描述的大多数实验中，在23°C生长的鼠疫耶尔森氏菌和/或假结核耶尔森菌(F1阴性的轻度致病性耶尔森氏菌)被用作阴性对照细菌。
基于使用鼠疫全细胞ELISA(全细胞ELISA，图1A)或重组F1V抗原(补充图S2)的ELISA，6个αF1Ig中有5个与F1阳性鼠疫菌(活的和固定的)结合，6个αF1Ig中的4个与F1V结合。
抗体与细胞表达的F1和纯化的F1V抗原结合效率的差异可能是由于前者比后者更稳定。

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抗体产量水平 ig8最高

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用PE偶联抗体染色的细菌的流式细胞仪分析进一步证实了F1+鼠疫杆菌的抗体特异性(图1B)。
我们甚至能用肉眼分辨出F1+和F1-Y.pg鼠疫杆菌，因为只有抗体染色和离心后得到的F1+细胞小球呈粉红色，而F1-小球是奶油色的(图1B插图)。
抗F1小鼠抗体YPF19，一种商业化鼠疫抗体，（72. Available from:https://www.biocompare.com/pfu/110447/soids/598/ Antibodies/Yersinia_pestis.）作为阳性对照，以及人IgG的多克隆混合物作为阴性对照。

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抗体结合特异性
荧光显色F1+>F1->YPF19

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在这些抗体中，我们选择了αF1Ig 2和αF1Ig 8，这是基于开发准确、灵敏、便携的诊断和tar- getting治疗所需的特征。进一步衍生αF1Ig 2和
αF1Ig 8结合放射性金属用于替代抗生素应用。αF1Ig 2和αF1Ig 8的免疫活性不受展示背景的影响。它们作为噬菌体-58和酵母展示的单链抗体(补充图S1)保留了免疫反应性，表明αF1Ig 2和αF1Ig 8的功能不受展示环境的影响。它们在哺乳动物细胞中的平均表达量为IgG1(表1)，并且在37°C长期保存后的亲和力保持不变(图3)，这表明αF1Ig 2和αF1Ig 8可以开发成商业化产品。