非洲动物锥虫病的纳米抗体

傲慢与偏见

鉴定Nb44/Nb42识别靶蛋白用免疫捕获实验结合质谱分析
500g刚果椎虫分泌物（怎么会这么多？）和25ug的Nb42H混合后， 22℃作用2小时，用QuICkpick IMAC kit 试剂盒进行操作，每步纯化过程取20μl制样。
图中LANE4可见靶蛋白和纳米抗体一起被洗脱下来，绿色箭头所指处差不多位于55-70KDa位置，将目的蛋白从蛋白胶中切割下来，进行质谱分析。序列显示抗体结合的靶蛋白是刚果锥形虫的糖酵解酶丙酮酸激酶 (Uniprot ID: G0UYF4)。

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制备和纯化TcoPYK, TbrPYK 以及LmePYK蛋白：
表达纯化了三种不同寄生虫的丙酮酸激酶(TcoPYK)，用于鉴定Nb44/Nb42抗体对的特异性。
夹心ELISA法显示抗体对只和刚果椎虫的丙酮酸激酶特异性结合。

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表面等离子体共振BIAcore和尺寸排阻色谱

用于检测Nb42和Nb44与TcoPYK之间的关系，
对于Nb42:TcoPYK复合物，可按照标准操作收集数据。
对于Nb44与TcoPYK复合物，由于缺乏合适的再生条件，以动力学滴定的格式收集数据。
根据SPR数据显示，Nb-TcoPYK之间具有nM范围的亲和力，其中Nb42的结合最为紧密。


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傲慢与偏见

尺寸排阻色谱：
鉴定出TcoPYK以四聚体的形式存在。
采用滴定法分析Nb42:TcoPYK以及Nb44:TcoPYK结合的分子摩尔之比，分别是4：4以及4：2，即一个TcoPYK四聚体能结合2个Nb44分子， 一个TcoPYK四聚体能结合4个Nb42分子，提示了两个抗体是识别不同的不存在竞争关系的表位。

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进一步分析能否形成 (Nb44)2: (TcoPYK)4: (Nb42)4三方混合物，样品制备时，先加 Nb44和TcoPYK作用，再加Nb42抗体。结果显示，的确能形成三蛋白混合的形式存在，说明Nb44和Nb42竞争不同的表位。能用于后续检测试剂盒的开发。

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留白

傲慢与偏见

噬菌体ELISA:
经过三轮筛选后，挑取95个单克隆，接种到1ml的培养基中，用于表达纳米抗体。
每个克隆收取200ul周质提取物，各取100ul用于进行噬菌体ELISA
ELISA板包被刚果椎虫IL3000分泌物，每孔10ug。
加周质提取物进行抗原检测，加抗HA标签鼠单抗作为二抗。

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夹心ELISA进行配对抗体检测：
从PHAGE-ELISA鉴定出的5个阳性克隆，鉴定哪两个可以搭配成为抗体对。
捕获抗体(Nb20H, Nb26H, Nb42H, Nb44H, Nb45H)带有HIS标签，2ng/ul，包被ELISA板。
刚果椎虫分泌物作为待检测抗原，用PBS稀释，浓度调整为10ug/ml，每孔加样100ul。
检测抗体带有HA标签 (Nb20HA, Nb26HA, Nb42HA, Nb44HA,Nb45HA) ，浓度调整为1ng/ul，每孔加100ul。

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夹心ELISA进行配对抗体对的特异性检测：
Nb44/Nb42夹心ELISA用于检测椎虫感染的小鼠血清。
小鼠在感染后的第七天取血
Nb44H作为捕获抗体，每孔加入500ng。
Nb42HA作为检测抗体，每孔加入100ng。

傲慢与偏见

Nb44/Nb42夹心ELISA检测重组PYKs蛋白
Nb44H作为捕获抗体，每孔加500ng。
待检测蛋白TcoPYK, TbrPYK，LmePYK(PBS稀释至1 μg/ml)
Nb42HA作为检测抗体 (每孔加样量为500ng)。