Flavivirus reverse genetic systems, construction techniques and

傲慢与偏见

自动化的Sanger测序是第一代测序技术。

DNA sequencing method is recognized asthe ‘‘first-generation’’ technology, and newer DNA sequencing
methods are referred to as ‘‘next-generation’’ sequencing (NGS).
These new technologies utilize various strategies that rely ondifferent combinations of template preparation, sequencing and
imaging, high speed data analysis and throughput with the capacity to produce enormous quantities of sequence data both rapidly
and at increasingly lower cost. The first next-generation highthroughput sequencing technology, the 454 FLX pyrosequencing
platforms, became available in 2005. By early 2007, Illumina had
released the Genome Analyzer, then SOLiD was released (Glenn,
2011). This technological aspect of sequencing and analysis is
expanding rapidly with novel and improved platforms continuously being developed and released. The most recent examples
include Heliscope and Ion Torrent PGM which became available
in 2010. An important consequence of these developments is that
complete sequences can now be obtained rapidly regardless of origin, and whether or not they are already known. This rapid progress has totally altered the speed and ease with which reverse
genetics systems can be produced and used to study previously
inaccessible subjects.
DNA synthesis techniques and technologies are also evolving
rapidly to meet these new scientific demands. Entire genomes
can now be synthesized and as the demand has increased, de novo
synthesis has become a cheap alternative from which to obtain
cloned cDNA. One of many consequence of these improved methodologies is that it is now technically possible to resuscitate
viruses for which no infectious virions exist (Cello et al., 2002;
Tumpey et al., 2005) and in theory it should now be possible to create novel viruses synthetically. This approach was first explored by
Blight et al. (2000) for the creation of a replication-competent HCV
RNA replicon (Blight et al., 2000).
During the early stages of development in the 1980s, a lack of
adapted technologies and time constraints were the primary obstacles for generating reverse genetics models. Today, the production
of a reverse genetic system is a relatively simple step towards
understanding the mechanisms governing the biological functions
of viruses.

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反向遗传学技术：
反向遗传学是指从cDNA克隆到得到病毒。是研究病毒的重要工具，操作简单，病毒复制周期短，使得改构后的病毒表型能快速观察到。
可用于疫苗研制，载体开发，分析病毒基因，非编码区域序列，甚至是生命周期，致病性，和传播性。
用于黄热病毒研究的最常用和强有力的反向遗传学系统是感染性克隆技术，另外，还有类似的技术用于得到感染性病毒颗粒。

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1. 感染性克隆：
对于RNA病毒来讲，感染性克隆即RNA基因组序列能稳定插入到载体中，通过体外转录再重新大规模获得基因组RNA.
根据需要，对基因组进行定点突变，或者全程合成。
载体可选用合适的质粒，粘粒。
细菌为大肠杆菌或者酵母菌。
5端有DNA依赖的RNA聚合酶，用于体外转录或者直接转染合适的宿主细胞。

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转染基因组RNA转录子或者直接注射易感动物，均能得到拯救病毒颗粒。
在一些实验中，在基因组的3端加入丁型肝炎病毒核酶序列，在细胞中能完成自切割，留下完整的病毒RNA基因组序列，完成复制。
黄热病毒的感染性克隆为病毒研究提供了有效的工具，构建细菌质粒载体的全长cDNA克隆分子比较麻烦。因为这些载体不是很稳定，发生一些不可预知的诱导突变，由于病毒蛋白的表达对细菌有毒性作用。
为了得到稳定的感染性克隆，采用不同的宿主细菌，载体，启动子，或者其他策略来对黄热病毒基因组中潜在的细菌启动子进行突变。

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1.1. 产生cDNA
在已知基因组序列全长，或者知道5‘和3’端序列的情况下，构建感染性克隆首先需要获得高保真的全长cDNA产物。
早期主要是通过亚克隆的方法，先构建一些cDNA短片段的克隆，一点点进行拼接。
后来，使用高保真酶以及优化反应条件，能够得到长度正确的cDNA扩增子。
并且，全程合成cDNA也成为可行的实验技术，但是目前还不是最好的选择。
无论采用哪个方法，得到的全长序列需要和母株基因组进行比较。

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1.2. 选择宿主
1.2.1. 细菌
1.2.1.1. 不同的菌株
大肠杆菌是最为常用的用于扩增cDNA的宿主。这些细菌的生理学和遗传学信息已经比较清楚，利用不同菌的不同特点可以进行选择。
不同的菌株可能具有不同的抗性，如氯霉素，氨苄抗性，四环素抗性，链霉素抗性。
如BL21菌的染色体携带T7 RNA聚合酶基因
有适合大片段克隆的细菌DH1, Topp-10
生长快速的细菌DH5a和turbo细菌。
不具有甲基化DNA功能的细菌DM1。
重组功能降低或者缺失的突变菌，从而降低了DNA克隆有重复序列时发生重组可能性的可能，转化效率增高（Novablue）
对于有毒蛋白质粒能降低拷贝数的菌 (ABLE C)。
尽管有许多细菌可以选择，但是并不存在一个既能降低毒性的通用细菌。
不同的细菌用于如DENV-4 cDNA，DENV1–4嵌合病毒，DENV-2， DENV-3或者TBEV 。

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1.2.1.2. 不同的载体
分子克隆技术起源于1970s。
在选择质粒时，要考虑的诸多因素包括插入片段的大小，拷贝数，选择标记等
质粒：未携带质粒的细菌，比携带质粒的细菌有生长优势。一些克隆菌株的大肠杆菌天生就对某些抗生素有耐药性。在这些情况下，这些抗生素不能用来选择携带质粒的细菌。理论上讲，质粒载体能携带低于15kb的DNA片段，超过这个大小的插入片段会对质粒的有效复制产生限制，影响质粒的稳定性。
一些质粒用于大片段基因的插入，质粒的复制原点决定了质粒的拷贝数。
大多数情况下，一小段DNA用于后续操作中的保留和扩增DNA序列，可以选用高拷贝的质粒。
但是，在构建黄热病毒感染性克隆时，因为在病毒基因组序列中存在一些可能隐形原核表达启动子序列，从而产生有毒的病毒蛋白，对细菌产生毒性作用。

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低拷贝质粒能严格调控原核启动子，维持在一个低水平的基础表达，原核转录终止子阻碍外源基因的假转录，有效改善黄热病毒感染性克隆构建。
采用这个策略用于TBEV的构建，载体选用pBR322；MVEV毒株1-51构建时，载体选用pMC18；YFV构建时，载体选用pACYC177。
类似的构建策略还用于DENV-2，WNV，KUNV或者TBEV 构建中。但是，这个策略并不适用于所有的病毒，如JEV cDNA，用低，中，高拷贝都无法获得稳定的感染性克隆。

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人工细菌染色体(BAC) ：
环形DNA分子，能容纳DNA大片段至350kb，高容量特性使得BAC最初用于构建大的DNA病毒感染性克隆，如杆状病毒，疱疹病毒等。BAC技术后续引入到黄热病毒感染性克隆的构建，如JEV cDNAs即将JEV基因组插入到BAC载体中。
此外，还有YFV，DENV-1，DENV-2等。

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粘粒：
粘粒如Expand Vector I，含有一段包括粘末端 (cos)的λ噬菌体，能容纳7-17kb的长片段序列。
证明比其他质粒pBR322, pKS, pUC or pGEM，更合适用于JEV全长cDNA克隆的构建。