single domain antibodies：methods and protocols

傲慢与偏见

Fab片段为抗原结合片段，是抗体结构中可以与抗原结合的区域，分子量为47-48 kDa。Fab片段的制备有酶解法、利用表达系统制备以及利用噬菌体展示技术进行抗体库筛选等方法。Fab类抗体片段具有分子质量小、组织分布特异性强、免疫原型低、可基因工程操作等特点，使Fab成为了医药研究领域的重要成员之一，Fab类药物在预防、诊断、治疗等领域有着广泛的应用。上市的赛妥珠单抗（Fab片段），可以有效地针对类风湿性关节炎；美妥昔单抗（Fab片段）已经用于治疗肺癌等。

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虽然已经发现Fab和Fc片段都发挥着重要的生物学功能，但是作为治疗性抗体片段药物进展很慢。Fc片段可以代替静脉注射免疫球蛋白(IVIg)用于治疗急性免疫性血小板减少性紫癜(ITP)。
Fab片段和放射性分子结合成用于成像和放射免疫治疗(RIT)，20世纪80年代早期，Fab片段开始用于构建双特异性抗体。
通过结合细胞上激活分子，如CD3分子（T细胞），FcγRI（中性细胞，活化的巨噬细胞），FcγRIII（NK细胞，活化的巨噬细胞，单核细胞亚群，T细胞）来招募免疫系统效应细胞，发挥抗肿瘤活性。
但是，通过生化作用制备双抗遇到很多问题，包括两个亲本抗体的GMP制备生产获得Fab’片段，通过化学反应将两个Fab‘片段进行偶联，双抗纯化等，步骤费时费钱。

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90年代初，Inbar等发现蛋白酶水解消化后形成的Fv片段，即25 kDa的VH-VL异质二聚体是一个完整的抗原结合位点。由此，通过基因工程技术可以获得Fv片段，单链抗体ScFv，双抗分子，进行原核表达。
ScFv由一个重链可变区(VH)和一个轻链可变区(VL)构成，两片段之间由三个串联的GGGGS进行连接。
早期构建得到的双价/双抗稳定性不好，容易聚集，不合适大规模生产。
现在，双抗构建技术越来越多，得到了更多能用于临床使用的双抗分子。

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利用分子工程技术构建单链抗体片段也引出了“胞内抗体”的概念。即抗体分子在细胞内进行表达，靶向细胞内抗原，如病毒抗原，肿瘤因子，致癌基因，肿瘤抑制基因产物，或细胞表面受体。
胞内抗体可以实现对细胞内蛋白质功能的长效抑制，可以被特异性地转运到细胞质，细胞核，或内质网的特定区域，并与相应的抗原结合。
胞内抗体主要是由中和抗体构建而得，胞内抗体的表型敲除是通过抗体的C末端与KDEL序列结合，滞留分泌途径上相关分子，来实现对细胞相关分子的功能研究，是非常好的蛋白质抑制剂。

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首先，这种方法是抗体治疗和基因治疗的结合，依赖抗体片段能否在靶细胞内有效传递。
第二，抗体分子在细胞质的还原环境中难以形成二硫键，结构稳定性差，在胞内容易发生聚集。
此外，胞内抗体的单体，二价形式，表达水平，细胞内定位都对抗体功能有影响。

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抗体片段的另一个有意义的应用是“T-Bodies”，即第一代的CAR-T，它开创性地将单链抗体特和来自于TCR-CD3复合物中CD3ζ的信号转导区域，使得表达T-body的T细胞具有直接识别肿瘤表面抗原的能力。

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以抗体片段开发成治疗抗体药物也来自两个观察：① 1989年发现，原核表达得到的13KDa大小的VH片段，依旧有很强的抗原结合能力，亲合力在20nM左右，可以非常灵活地构建各种抗体片段，可用于诊断，治疗。
② 在驼类血清中发现的重链抗体，展示了很强的抗原结合能力，可能用于临床研究。
这些抗体片段分子和单域抗体和全抗比较，有一些由于分子量小带来的优势。

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2012版 第二章：
原版，可下载

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人重链基因组包括：
① 先导序列基因(leader sequence, L)：引导重链穿越内质网，进入内质网腔，穿膜后先到肽被酶水解。
② 可变区基因(variable region，VH)：
③ 多样性基因(diversity，D):
④ 连接基因(joining, JH):
⑤ 恒定区基因(constant region，CH）
它们之间被非编码的DNA隔离。

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SdAb这个概念最开始来自Ward。
描述鼠抗的VH区，可以和溶菌酶结合。
亲合力很好，但是可溶性不好，可能和缺失VL有关。
骆驼重链抗体的出现改善了这种情况，应运而生VHH。