猪瘟病毒E2 基因噬菌体展示多肽库的构建及表位鉴定

米小圈

噬菌体的原位杂交
(1) 将淘选到的噬菌斑（约500个）铺于固体平板，形成噬菌斑，于4℃预冷，取S＆S膜轻铺于上层琼脂糖凝胶上。对S＆S膜和平板都进行标记。静止5min左右，小心将S＆S膜从平板中取出，将平板置于4℃保存备用。(2) 将取出的S＆S膜翻转，干燥10～20min
(3) 将脱脂奶粉溶于TBST中配制成5％的封闭液，按照每张膜25～50mL的量加入封闭液，37℃，轻轻摇动封闭2h
(4) TBST洗涤3次，每次5min
(5) 加入相应的用于富集的抗体，37℃，轻轻摇动反应2h。
(7) 针对不同来源的抗体加入HRP标记的二抗，37℃，轻轻摇动反应1h
(8) TBST洗涤5次，每次5min
(9) DAB显色5～10min，蒸馏水终止反应。观察结果。出现空心显色斑的判定为阴性结果，出现为实心显色斑的判定为阳性结果

这篇文章里并没有给出相应的图片，硕士论文里图片也非常不清楚。结果不是很有说服力。

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重组噬菌体的PCR扩增及测序
挑取与S &S 膜上阳性结果对应的噬菌斑加到100μL的10 mM EDTA 溶液中，振荡，65 ℃温育10 min 。冷却至室温，14000rpm离心3min，取1～2μL上清作为模板，用T7 上游引物和T7 下游引物进行PCR 扩增。阳性PCR 产物进行胶回收，测序。
T7 上游引物( 5′-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3′)
T7 下游引物( 5′-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3′)

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重组噬菌体筛选及序列测定结果
采用F105 、F108 、高免血清从SM2E2 库中，1B3423729 从HCLV2E2 库中，M11、1E2 从SM2E2 、HCLV2E2 库中都筛选到与TAVSPTTLR高度同源的序列;
高免血清从SM2E2 库中筛选到了与YYEP 高度同源的序列。
从HCLV2E2 库中也获得了与模拟表位TTWKEYSH 高度同源的序列。
单抗4B30-3-1 筛选的表位与SM2E2 库中GGQVK(887-891 aa) 序列高度同源，与HCLV-E2 库的GGVVK(887-891aa) 序列高度同源。
单抗M56 在HCLV2E2 库中筛选到PDGLPHY(903-909 aa) 高度同源序列。

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筛选的同源序列与预测表位比较结果
将SM和HCLV株E2氨基酸序列于htp:/www.cbs.dtu.dk/services/进行表位预测，有17个潜在抗原表位区域。CSFV E2中存在的抗原表位目前已经报道有YYEP（995aa-998aa)、 TAVSPTTLR(829aa-837aa)和一个模拟表位 TTWKEYSH（717aa～-724aa)。
本研究中除了检测到这三个表位外，又淘选到可能存在的潜在抗原表位。GGQ(V)VK(887aa-891aa) 和PDGLPHY(903aa-909aa)

将这两个潜在表位序列分别与多株CSFV毒株，BVDV毒株，BDV毒株进行同源性分析。
显示GGQ(V)VK(887aa-891aa)在猪瘟病毒中保守性较高，在瘟病毒属的其他病毒中存在较大的差异。
PDGLPHY(903aa-909aa)在猪瘟病毒中比较保守，在瘟病毒属多的其它病毒中差异性较小。