Rapid Construction of a Replication-Competent Infectious Clone of Human A

傲慢与偏见

重组病毒感染A549细胞后三天，负染法处理样品，FEI Tecnai-12 电镜下可以看到典型的腺病毒颗粒，70-90nm大小。

傲慢与偏见

在挑取的12个菌落中，除了三个阳性质粒外，其他九个未能成功构建的质粒大小和pBR322质粒大小相似。
经过测序发现，是pBR322在ECoR I酶切位点处恰好多了一个AsiS I酶切位点。
根据Gibson组装原理可以看到因为AsiS I是一个回文结构序列，产生这种多了一个AsiS I酶切位点的质粒有很大的可能性，能解释通。

傲慢与偏见

2005年，HAdV-B14 重新在美国，加拿大，欧洲，亚洲等多地出现，导致越来越多的ARD爆发，严重者致死。目前，针对HAdV-B14感染尚无有效预防和治疗的的疫苗和抗病毒药物，HAdV-B14感染性克隆的成功构建会有助于研究病毒基因组功能，致病性机理，重组机制，以及研制抗病毒药物和疫苗。
对于大基因组病毒的感染性克隆的构建，目前常用的手段是利用同源重组技术，常用的同源重组菌有，E. coli BJ5183, GB05-dir, 或者预转pKD46质粒的DH10B。采用同源重组技术的缺点是比较耗时，同源臂要求比较长（500bp），筛检和鉴定阳性克隆比较麻烦，可重复性差。同源重组的方法差不多用时7-14天，Gibson组装用时低至3天。
本文中先后两次用Gibson组装构建HAdV-B14的感染性克隆，第一次从4个菌落中筛选到一个阳性克隆，第二次从八个菌落中筛选到两个阳性克隆。
Gibson组装简单，有效，耗时短，阳性率高，重复性好，也用于其他，如菜豆皱缩花叶病毒，植物RNA病毒基因组的组装。同源重组的方法构建感染性克隆需要用含有重组酶的特殊菌株，由于腺病毒基因组较大，含有一些重复序列或者高级二级结构，所以在构建质粒的过程中可能发生一些意想不到的重组，造成核苷酸增加，缺失，或者重排等等，对于质粒的感染性来说可能是致死性突变。
而Gibson组装发生这些突变的概率非常小。
质粒pBRAdV14的获得为HAdV-B14复制缺陷型载体的研究提供了基础，从而进行疫苗开发和基因治疗的研究。目前，传统的腺病毒载体主要是基于C型的HAdV-5和HAdV-2构建的，但是由于这两型病毒广泛的自然感染，所以很多人体内存在预先免疫，因此这些传统腺病毒载体的广泛应用受到限制。HAdV-B14病毒是一种突发型病原体，不存在预先免疫，可以尝试开发为一个新型腺病毒载体。