An infectious West Nile Virus that expresses a GFP reporter gene

米小圈

病毒WNII-GFP感染原代细胞
黄热病毒在体外有很广的嗜细胞性，本研究中，鉴定出病毒颗粒WNII-GFP能感染 Vero, 293T, HeLa, QT-6,CCC, U87, BHK-21, K562, Raji等，不过感染能力各有不同。
带有报告基因的WNII病毒能可以用于检测WNV对不同细胞的感染性，首先检测生理相关的细胞类型，感染颈上神经节分离的人树突细胞和大鼠交感神经元细胞。
树突状细胞iDCs是抗原递呈细胞，诱导原发免疫反应。未成熟免疫细胞具有强大的抗原摄取和处理能力。人体中主要有两类iDCs，分别存在于皮肤真皮的间质细胞和皮肤表皮的朗罕细胞。本研究中体外培养从而获取单核细胞来源的树突细胞（MDDCs）的方法是，单核细胞在GM-CSF和IL-4联合作用下诱导分化成未成熟的树突细胞，在培养结束前用LPS刺激进一步分化成为成熟DC。iDCs表面有DC-SIGN和CD11c的表达，可以用于iDCs的检测实验。

本研究中具体的实验方法如下：
iDCs的制备：单核细胞(至少90% CD14 阳性) 用RPMI 1640培养7-8天，加入10ng/ml人GM-CSF和20 ng/ml IL-4 联合诱导分化成为未成熟树突细胞，在第6天，可以通过流式对树突细胞的纯度进行评价，未成熟的DCs表现为 CD11+, DC-SIGN+ CD83-,CD14-。
WNII-GFP按照MOI=1感染iDCs细胞，在三次独立的实验中，我们观察到只有少数iDCs能观察到GFP的表达（图A)，并且提前用单抗7H2(0.74 mg/ml，稀释200倍),和病毒孵育后，病毒的感染能力丧失。
病毒感染DCs的能力也被检测，DCs的制备，需要在感染前48小时加100 ng/ml LPS 进行刺激，WNII-GFP按照MOI=1感染细胞。
iDCs为了对脂多糖和其他抗原分子有应答，转移到淋巴结中，细胞表面蛋白CD83分子表达上调， 同时CD80和CD86表达量也有所增高。
这些被激活的mDCs细胞能刺激抗原特异性的T细胞被激活和增殖，用LPs激活的iDCs经 WNII-GFP感染，并不能检测到GFP表达，而mDCs经过LPS刺激后表达IFN-β可能是刺激后的树突状细胞对WNV没有易感性的原因。
WNV具有嗜神经的特性，能感染很多神经细胞，包括运动神经元细胞。用WNII-GFP感染神经细胞，如大鼠颈上神经节交感运动神经元 (SCG) ，检测GFP和病毒抗原蛋白表达，I型WNV毒株New York 2000能持续感染这些细胞，长时间释放感染性病毒颗粒。
同样，用moi=50的WNII-GFP感染SCG细胞，在感染后第六天同样能观察到GFP表达以及病毒蛋白表达，说明WNII-GFP能够感染神经元细胞。（图B）

米小圈

WNV进入细胞和复制时抗体和干扰素介导的抑制作用
通过流式检测WNII-GFP感染细胞后表达GFP的情况，可以用于对WNV进入细胞和复制的机制研究。本研究中选用两个抗体7H2和5H10进行病毒抑制性研究，这两个抗体通过和WNV DIII区结合阻止病毒进入细胞
1000pfu的WNII-GFP和系列稀释的抗体在体外孵育1小时后，感染BHK-21细胞，36小时后，流式分析GFP表达情况。
抗体的阻止能力和WNII-GFP的感染能力呈剂量效应关系。两种抗体降低病毒的50%感染力的剂量分别是1.03 ng/ml和3.05 ng/ml。
带有报告基因的病毒能用于抗体介导的病毒中和活性检测。I型干扰素(IFN a和β)已经证实能对多种黄病毒有体内体外的抗病毒活性，干扰素的抑制病毒能力可能和病毒基因组进入感染细胞胞浆后，能阻断病毒RNA的翻译和复制过程。
不同浓度的IFN-β处理hela细胞和HEK-293T约12小时后，用WNII-GFP感染细胞，由图8B可见，HELA细胞对IFN-β介导的抑制病毒作用更敏感。

米小圈

讨论部分摘要：
本研究中，构建了一个能高效表达GFP的WNV感染性克隆。这个感染性克隆是DNA-based感染性克隆，不同于以往的RNA-based感染性克隆。DNA-based感染性克隆关键在于DNA转染细胞后产生的RNA需要保证全长无缺失，两端的核苷酸序列高度保真，能够进行复制。
DNA-based感染性克隆优点在于操作简单，能直接转染细胞产生病毒。缺点在于稳定性不够好，尤其是在细菌中真核启动子有一点低水平的活性加速d质粒的不稳定性，因此限制了DNA感染性克隆的应用。
本研究中构建了WNV两种形式的感染性克隆，之前有报道RNA-based感染性克隆能够表达报告基因，但是在我们的实验中，构建的RNA形式的插入GFP报告基因的感染性克隆并没有获得表达GFP的重组病毒。
可能的原因是体外未能有效合成11kb的WNV RNA，因此无法获得重组病毒颗粒。
DNA-based感染性克隆的成功构建，方便在基因组中快速引入位点突变等，有利于在病毒进入细胞以及复制等过程中，研究病毒蛋白的结构和功能。

米小圈

讨论部分摘要：
利用WNII-GFP系统能够快速有效监测到WNV进入细胞和复制过程，对黄病毒的机制和应用研究很有帮助，比如可以筛选新颖的治疗措施等。一些阻碍HIV-1感染的病毒抑制剂体外实验证实很有效，已用于临床实验评价。
病毒进入抑制剂的筛选以及结合对病毒进入细胞的膜融合蛋白研究促使病毒如何进入细胞的机制研究成为一个热点研究。
除了一些小分子抑制剂，对WNV感染的免疫治疗研究一样有前景。带有报告基因的WNV病毒在进行中和抗体结合实验中有检测更为快速的优势，还能用于不能形成噬斑的细胞类型，可以检测抗体对病毒感染的抑制作用等等。

米小圈

讨论部分摘要
在带有报告基因的病毒颗粒研制成功之前，黄热病毒带有报告基因的复制子载体多有报道，包括WNV也有相应的复制子表达系统，复制子载体虽然删除了大段的结构蛋白，但是RNAs依旧保留在胞浆中进行复制的能力，为病毒复制研究提供一个研究手段和平台。另外，这些复制子载体也可以通过反式提供结构蛋白包装成为假病毒，用于研究病毒的进入，复制和筛选新型抑制剂等。
WNII-GEP的成功获得让研究变得更简单快速有效。还可以用于病毒嗜性的研究，
用WNII-GFP感染小鼠能直接，定量体内WNV感染情况。 鉴定病毒感染后的靶细胞，细胞如何迁移，如何感染内脏器官，等等
但是WNII-GFP容易丢失GFP报告基因也限制了该病毒的体内应用，感染后3-4天病毒颗粒相对稳定，可以用于体内实验。