Differential effect of the Deletion of African Swine fever virus virulence...

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感染后实验猪的病毒血症

HA定量检测实验猪感染病毒后，不同时间节点的病毒血症（图5A-C）。

感染母株ASFV-G毒株后，实验猪具有非常高的病毒血症直至其死亡。

感染ASFV-G-△UK的动物在血液中具有比较高的病毒滴度，平均滴度仅在接种第4天时略微降低。

和临床表现一致，在感染ASFV-G-ΔNL的组中，死亡的猪在病毒接种第5天时呈现高病毒血症滴度，而其余存活的四只动物表现出不同的病毒血症。

其中一只从第7天开始至观察期结束，病毒血症滴度恒定较高（约10^6.36 HAD50/mL，标准差为0.24）。第二只动物表现出相似的动力学，平均滴度为10^4.99 HAD50/mL，标准差为0.55，而第三只动物的平均滴度为10^3.61 HAD50/mL，标准差为0.82。这三只动物的体温都有周期性的短暂升高(如图5D)。第四只动物在测试的任何时间点都没有出现任何可检测的病毒血症。

总知，病毒血症值与临床疾病表现，病毒生长动力曲线密切相关。

由以上结果可见，UK基因的缺失没有改变ASFV-G毒株的毒力， NL基因的缺失也不能完全减弱病毒毒力。因为E70和Georgia 2010分离株之间，NL和UK基因具有高度同源性，说明不同毒株的基因遗传背景在毒力强弱中具有重要意义。

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候选疫苗ASFV-G-Δ9GL/ΔUK中NL基因的缺失影响对亲本病毒攻击的保护作用
NL的缺失可以使ASFV-G毒力显著降低，因此将候选疫苗ASFV-G-Δ9GL/ΔUK进一步删除NL基因，看三基因缺失的重组病毒ASFV-G-Δ9GL/ΔNL/ΔUK是否增加疫苗的安全性。通过NGS分析ASFV-G-Δ9GL/ΔNL/ΔUK基因组和设计一致，NL基因已经被删除。
参见9楼图3，评估ASFV-G-Δ9GL/ΔNL/ΔUK在猪巨噬细胞中的体外生长能力，并与其他重组病毒和亲本ASFV-G进行比较。结果显示和ASFV-G-Δ9GL/ΔNL相比(备注：原文中写的是ASFV-G-Δ9GL/ΔUK，根据论文和图3判断，应该是写错了），ASFV-G-Δ9GL/ΔNL/ΔUK的生长动力学降低约100倍，与亲本ASFV-G病毒相比，降低约1000倍（图3）。
进一步评估NL基因缺失对候选疫苗株ASFV-G-Δ9GL/ΔUK保护作用的影响，对5只实验猪肌肉注射接种104 HAD50重组病毒，并在28天后，感染102 HAD50的亲本株ASFV-G。结果发现，所有接种的动物在病毒攻击之前没有临床症状。与先前描述的ASFV-G-Δ9GL或ASFV-G-Δ9GL/ΔUK相比较，ASFV-GΔ9GL/ΔNL/ΔUK的病毒复制水平较低，病毒血症不明显，（图6），由ASFV-G-Δ9GL/ΔNL/ΔUK感染引起的特异性ASFV抗体应答非常低。

图6. ASFV-GΔ9GL/ΔNL/ΔUK感染猪后血液中的病毒滴度。

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亲本病毒攻毒后，所有接种ASFV-G-Δ9GL/ΔNL/ΔUK的实验猪与对照组动物出现一致的临床症状。第4天发病，第6天处死。（表2）。两组动物的病毒血症的动力学或量级也没有检测到差异。

表2 感染ASFV-G-Δ9GL/ΔNL/ΔUK的动物的生存率和发热反应，并在28天后接种10^2 HAD50的亲本ASFV-G。
以上的实验结果证明NL基因的缺失降低了ASFV-G-Δ9GL/ΔUK候选疫苗在体外细胞培养和体内复制的能力，无法诱导针对亲本毒性病毒攻击的保护作用。ASFV-G-Δ9GL/ΔNL/ΔUK在猪体内的低复制能力可能是导致其对强毒病毒的攻击无法进行保护的原因。

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讨论：目前为止还没有可用于预防ASFV感染的疫苗，报道称减毒株可用于保护猪免受同源强毒株的攻击，病毒通过在细胞培养中连续传代以及进行遗传基因突变筛选减毒株。通过基因工程获得的减毒株，其通常手段是将病毒毒性相关的特定基因的删除。
已报道有6种不同基因/基因组的缺失能够减弱ASFV的毒性：

ASFV E70毒株中 的NL (DP71L) 或者UK (DP69R基因)

适应Vero细胞生长的毒株Malawi Lil-20/1, Haiti 以及Georgia毒株中的 TK(A240L)基因

Malawi Lil-20/1，Pretoriuskop/96/4 ，以及Georgia毒株中的9GL (B119L) 基因

Georgia 和Benin毒株中多基因家族MGF360/505中第6/9基因

在这几例报道中，注射了这些基因缺失毒株后的免疫猪能抵抗病毒感染。猪瘟病毒之间的交叉保护作用非常弱，因此，不同病毒株之间毒力基因是否一致有待进一步验证。

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TK (A240L)基因是猪瘟病毒株中高度保守，适应 Vero细胞生长的毒株Malawi Lil-20/1，Haiti H811和Georgia在删除TK基因后，病毒毒力获得相似的毒力下降。

9GL（B119L）基因在目前已测序的ASFV分离株中也是高度保守。强毒株Malawi Lil-20/1和Pretoriuskop/96/4中删除该基因后，毒力能有效下降，并诱导相应的保护作用。这个特性使得9GL作为一种候选靶基因，以产生减毒活疫苗。然而最近的研究表明，在Georgia分离株中，9GL的缺失并没有引起毒力的减弱，只有当以低剂量接种时，才能观察到9GL缺失的Georgia分离株的病毒毒力显著降低。

NL基因在不同的病毒分离株中存在很大差异。NL基因以两种不同的形式存在：长型（184氨基酸），在Malawi Lil-20/1分离株中发现，以及短型（70-72氨基酸），在很多已测序的病毒株内中。

在ASFV E70分离株中NL基因（短型）缺失，毒株毒力下降，而ASFV Malawi Lil-20/1毒株NL基因（长型）缺失则不会导致病毒的减毒。两个毒株编码的NL蛋白差别显著，可能解释了接种NL缺失突变病毒株后表型差异显著。

NL基因（短型）和UK基因在所有ASFV分离株中都非常保守。蛋白质同源性分析显示NL和UK蛋白在ASFV分离株中高度相似，其中E70和Georgia之间，两个基因具有超过94％和96％的氨基酸同源性，各毒株表型之间的差异很可能是多个基因的作用共同介导的，目前为止积累的证据很难推测在ASFVGeorgia 2007分离株中究竟是哪些基因主宰病毒的毒性。在不同的ASFV毒株中，其他的病毒相关基因的数量或功能可能改变NL和UK基因对一个毒株毒力的影响。这也解释了为什么E70毒株在删除了NL/UK基因后毒力下降，而ASFV-G毒株删除NL/UK基因后毒力变化不大。

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本研究结果表明，ASFV-G病毒株删除UK基因后毒力无变化，但是ASFV-G-D9GL候选疫苗减毒株仅进一步删除UK基因后毒力进一步下降。同样，NL在ASFV-G毒株中毒力的改变也并不完全类似于ASFV E70毒株，表明Georgia毒株的毒性和病毒其它毒力相关基因也有关。Malawi Lil-20/1，Pretoriuskop/96/4和Georgia等毒株中9GL基因的缺失导致不同的表型，表明ASFV毒力是多基因共同作用的结果。

支持这一假设的实验数据有，ASFV E70毒株删除NL基因后毒力降低，插入一组MGF360/530，可以提高ASFV E70毒株的毒性。MGF基因在E70毒株中天然缺失，插入该毒株后毒性升高说明该基因是一个重要的病毒毒力基因。

本研究也说明，尽管E70和ASFV-G毒株的UK和NL基因具有很高的氨基酸同源性，但其他遗传因素也影响了ASFV的毒力。因此，我们在开发新型ASFV疫苗需要谨慎，对一个新出现的野生毒株，不能直接用已有的报道数据，简单的将某些基因删除以期得到毒性降低的候选疫苗株。