鼠源性抗雄性特异性抗原噬菌体 Fab 抗体库的构建

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PCOMB3 插入Fd区和轻链区序列如图所示：

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小鼠重链可变区引物
5′引物5′primer 5′TGG AGG CTT CTC SA G GTG MA G CTK CAS SAR TCW GG 3′
3′引物3′primer 5′TGG GGS TGT YGT ACT A GT TGM RGA GAC RGT GA 3′

重新分析本研究中设计的重链可变区引物，在下游引物有酶切位点Spe I:ACTAGT，而上游引物中并没有看到有单一的Xho I酶切位点，CTCSAG中有50%的概率会出现Xho I酶切位点，这样设计引物造成的结果是扩增出的重链基因有一半的概率不能通过用S pe I 和X ho I 双酶切，回收后和轻链基因的质粒进行连接，构建Fab库。

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噬菌体抗体库构建
Fab基因抗体库经过VCSM13辅助噬菌体的超感染后，用PEG沉淀噬菌体，测得抗体滴度为3.2*10^11pfu/ml。

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噬菌体抗体的雄性特异性分析
间接ELISA法检测展示 Fab 的噬菌体原始库的18 个克隆，结果显示以雄鼠脾细胞作为抗原时有 9 个克隆 ( E2、 A3、 E3、 A5、 E5、 A6、 E7、 A9、 E9)含有雄性特异性的噬菌体抗体 (阳性率约为 50 %) ,并且噬菌体抗体与雄鼠脾细胞的结合活性明显高于雌鼠脾细胞。
以鼠睾丸细胞作为抗原时 ,有 8 个(E2、 A3、 E3、 A5、 E5、E7、 A9、 E9)克隆呈现较高的结合活性 (阳性率约为 44 %) 。说明 这些噬菌体抗体具有与 H2Y抗原特异性结合的活性。

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RNA的提取
mRNA 的完整性对噬菌体抗体库的构建效果影响很大，并且RNA 的完整性相比较 RNA 的纯度而言重要的多 。
对 RNA 提取步骤应尽量简化，减少 RNA 酶污染降解 RNA 的机会。

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抗体 Fab段基因的扩增

就目前人们所掌握的有限的免疫球蛋白的结构 序列信息来说 ,设计出把所有的抗体基因都扩增出来的通用引物还存在一些困难。

有时 ,利用设计良 好的引物进行 PCR 扩增也可能得不到满意结果 ,解 决的办法除使用巢式或半巢式 PCR 外 ,就是改进 PCR 程序。

phoenix_eagle

不知道这个Protocol怎么用？呵呵呵。