Subgenomic Replicons of the Flavivirus Kunjin: Construction and Applications

傲慢与偏见

进一步在复制子载体3-UTR区插入报告基因CAT，一方面是其本身为一个简单有效快速检测复制子能力的有效方法，另外也为后面的包装假病毒颗粒实验提供方便的检测手段。

CAT报告基因插入点位于终止密码子后的第25位，该位点不影响上游蛋白加工，在▲ME/76复制子的基础上，将EMCV IRES-CAT基因正反向插入3-UTR区添加了Mlu I的酶切位点处。

傲慢与偏见

用NS3抗体间接免疫荧光检测△ME/76CAT(-)RNA和△CME/76CAT(+)RNA电转BHK-21细胞后的复制情况。

和△ME/76RNA比较，复制能力降低了2倍以及10-20倍。5C图显示转染后48小时，Northern杂交显示▲ME/76CAT(—)组可以检测到KUN-和CAT-相应的特异性条带。
▲ME/76CAT(＋)组检测不到任何条带，和IE结果比较一致。
除此之外，运用CAT实验检测细胞裂解物中CAT的表达情况，5B显示▲ME/76CAT(—)组未见CAT表达，而▲ME/76CAT(—)组CAT表达明显。
和上面的IF结合和NORTHERN结果貌似不一致，为什么呢？

傲慢与偏见

继续用CAT报告基因评价3-UTR区大片段的删除对于复制子RNA的复制能力的影响。构建复制子∆ ME/352CAT(＋), 如图1L，正向插入IRES-CAT基因，
IF检测，加入CAT基因后，∆ ME/352CAT(＋)转染后48小时，以抗NS3抗体进行检测的IFA结果显示有，和∆ ME/352相比差几倍。和∆ ME/76CAT(＋)相比，CAT报告基因检测出CAT表达量要高很多(Fig. 5B)。
在平行的LSC实验中，∆ME/76CAT(＋)和∆ME/352CAT(＋)转染后的细胞中辐射信号分别为7020cpm和1307cpm，是空白细胞的18.6倍和3.5倍。
这些实验和图5中的Northern和CAT检测实验一致。

傲慢与偏见

建立复制子稳转细胞系：
▲ME复制子电转BHK-21细胞后在第15天还能监测到NS3蛋白的表达，为了延长蛋白表达时间和增加阳性细胞表达数，在3-UTR区插入NEO基因，构建∆ME/76NEO，通过G418进行筛选，获得稳转细胞系。
和▲ME/76CAT相似，48小时，IF监测仅有少量细胞呈阳性，用G418持续加压，转染后41天，差不多9代，大部分细胞呈现阳性，图A分别代表转染后第16.25.41天的IF结果。
和正常BHK-21细胞相比较，转染细胞生长更为缓慢，但是没有明显的CPE变化。

傲慢与偏见

Northern杂交能检测到△ME/76Neo复制子稳转细胞系第2，5，9代细胞Neo基因条带。
大约为10.5kb左右。
免疫沉降实验能检测到△ME/76Neo转染后第16天，即第二代细胞中KUN NS3蛋白的表达，和KUN病毒感染细胞产生的NS3大小一致。

傲慢与偏见

讨论部分：
本研究中构建了一系列的复制子载体。主要是C基因和UTR区进行删除。建立一系列实验对其复制和表达能力进行检测
全长感染性克隆，各种复制子转染细胞后6小时，IFA，RT-PCR，Northern杂交结果均为阴性。
24小时后，感染性克隆和有些复制子的检测实验开始出现阳性结果。
但是▲CME和C2rep在24，48，72小时，各种检测均为阴性，说明▲CME和C2rep两个复制子有大片段的删除，虽然体外翻译能力不受影响，但是体内复制能力丧失。
C20rep复制能力还存在，说明C基因5端的前20个氨基酸序列和复制有关，分析序列可见在137-144处有一段环化序列。对于病毒的复制能力至关重要。

傲慢与偏见

去除复制子载体中3＊UTR的片段
RNA△ME/76是在RNA△ME(C417--E2403)基础上去除3＊UTR(10423-10498)上76个核苷酸，RNA复制力不受影响。
RNA△ME/352是在RNA△ME(C417--E2403)基础上去除3＊UTR(10423-10774)上352个核苷酸，包括两个保守序列RCS3和CS3，复制能力受到抑制。
这部分实验数据和报道中的DEN-4病毒比较相似，环化序列破坏后丧失复制活性。

傲慢与偏见

Encouraged by the efficiency of replication of DME/76 containing
a unique MluI restriction site 25 nucleotides downstream
from the stop codon, we used that site for further
insertion of IRES-foreign gene cassettes, initially the EMCV
IRES-CAT sequence, in both plus and minus senses. Although
DME/76CAT(1) replication was readily detected by CAT assay,
a strong inhibitory effect of the inserted sequence was
noted, presumably caused by competition on the same mRNA
between the KUN initiation codon and the IRES-mediated
initiation for the cellular translation machinery. This may
cause some limitation on the utility of this strategy for expression
of heterologous products. However, this strategy employing
the use of dicistronic replicons could still be applied for
monitoring the effects of deletions/mutations on replication
with sensitive enzyme assays. For example, the CAT assay was
sensitive enough to detect not only the replication of DME/
76CAT(1) RNA but also the difference in the replication
efficiency between two RNAs with different deletions in the
39UTR [compare the results for DME/76CAT(1) and DME/
352CAT(1) in Fig. 5B].