Molecular and Biological Characterization of Human Monoclonal Antibodies...

潇湘妃

中和活性实验
被检测的SCFV中，CR3013和CR3014能中和SARS-CoV毒株FM1 (Fig. 9). 将SCFV形式改成IgG形式后，中和活性能提高2-5倍。
CR3013, CR3014, 以及IgG从300 nM开始，和10, 30,100 TCID50的SARS病毒共同孵育，感染VERO细胞。
完全中和100TCID50病毒感染VERO细胞， CR3013需要达到170 nM，CR3014需要达到42 nM。
说明IgG CR3014中和能力更强，和之前其高结合力的结果一致。
CR3006在低浓度未有展示出中和活性，后续实验中观察到高浓度的CR3006能有一些中和活性。

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讨论部分：
本研究从半合成人抗体库中筛选到8株针对SARS-COV的全抗。
其中两株抗体针对N蛋白（CR3018和CR3009)，电镜下能看到抗体和N蛋白结合的金颗粒。
之前有报道，31个患者的血清中有9个血清中抗体和N蛋白的1-23表位结合。说明抗N抗体也是患者产生的一部分重要的中和抗体。
CR3018和CR3009两株抗体之间不产生竞争作用，应用PEPSCAN分析研究CR3009和CR3018抗体识别的N蛋白抗原表位。
CR3018识别表位定位到N蛋白的11-19个氨基酸，RSAPRITFG。该表位存在于所有的人SARS序列以及动物的SARS样毒株中，但是在其他冠状病毒中不存在。CR3009未能显示出具体和哪个肽结合，说明可能识别的是空间表位。

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分离出临床标本中的SARS-CoV病毒是确诊SARS感染的金标准，但是耗时长，比较麻烦。
PCR检测和检测血清中抗体阳转是一个诊断手段，但是大部分患者在第2-3周才能检测到血清阳转。
本研究中筛选到的特异性抗体可用于诊断试剂的开发，进行更快速和精准的早期诊断。

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本研究中除了筛选到抗N蛋白的抗体，还检测到四株抗S蛋白的抗体CR3006, CR3013, CR3014, 和CR3015。其中三株抗体能有效中和SARS-CoV感染VERO细胞。
不能中和SARS-CoV的抗体CR3015可能识别表位在S2区域。
CR3006, CR3013, CR3014抗体能竞争结合S1区域，具有不同的亲和力和中和活性。
抗体的亲和力和中和活性并不是完全呈正相关关系。

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进一步证明筛选到的中和抗体识别表位位于病毒S蛋白的ACE2-受体结合区，用pepscan分析进行更准确的定位。
但是用该技术并未有成功鉴定出CR3014抗体的线性表位。
之前80R抗体在还原和非还原条件下都能和S1结合。
S1蛋白去糖基化，也不能阻碍80R和S318-510区的结合。

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CR3014能识别所有S318-510突变株(8株），说明CR3014识别表位在所有的SARS-CoV病毒株保守序列中。
其中和6号蛋白结合能力较弱说明位点N479S的突变对CR3014结合能力有影响。
CR3006和突变蛋白5，8号不结合，说明Y442，F360, L472, D480, T487影响CR3006识别表位。
SARS患者体内中和抗体的预防作用和其他急性病毒性疾病，如甲肝患者血清中的抗体相似。
一个成功的用于治疗感染性疾病的抗体是预防和治疗婴儿的呼吸道合胞病毒感染疾病。
抗SARS的中和抗体也可能会成为预防SARS-CoV感染的一个有效免疫预防手段。

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最后，我们评价了CR3014抗体对雪貂抗SARS感染的保护作用。（文章正文中未见这些数据）
通过气管途径使雪貂感染病毒，在肺部可导致大面积的感染，和不同程度的肺部损伤病变。
在感染后第4天肺部能检测到高滴度的病毒，第7天有所下降。
而加了CR3014抗体的病毒感染雪貂，则几乎检测不到病毒。
在后续的研究中，证明10 mg/ml剂量的CR3014能降低SARS-COV病毒在感染雪貂肺部中的复制。
阻止SARS病毒诱发大片的肺部病理学变化。
咽部分泌物的病毒量也有所减少。

以上数据说明SARS-CoV中和抗体能用于预防暴露于SARS-CoV人群被病毒感染，如医护人员等。
中和抗体也可以用于治疗SARS感染人群病情进一步发展，减少传播给他人的风险。