非洲动物锥虫病的纳米抗体

傲慢与偏见

ELISA的基质效应：当单个样本或少量样本值低于空白值时，可能是实验操作出现问题。当许多样本都低于空白值时，应思考基质效应的影响，建立校正曲线予以修改。
基质效应的原因错综复杂，有可能是样品中存在的基质导致原抗体的联络结合能力下降，便产生了样本值低于空白值的现象。导致样本值无法计算出数值，或许数值为负。
用线性稀释，一般来讲，抗原和捕获抗体、检测抗体之间的结合作用很强，样品浓度被稀释并不影响它们的结合，而造成基质效应的非特异结合的力要弱很多，如果不断稀释样品，非特异结合造成的干扰会逐步减少，测量值也更接近真实值。没有基质效应时，无论如何稀释，测量值都和真实值吻合。而有基质效应时，稀释会造成非特异性结合比例的减少，测量值也相应地产生很大改变。

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Nb44/Nb42 ELISA棋盘滴定为确定最佳工作浓度
PBS二倍稀释捕获抗体Nb44H (初始浓度为5μg/ml) ,每个浓度设置三个复孔。
重组的TcoPYK蛋白作为检测蛋白，PBS稀释，浓度调整为1ug/ml。
检测蛋白Nb42HA同样用PBS进行二倍稀释，起始浓度为25μg/ml。


由图可见，Nb44的浓度对ELISA的测定值影响更大。

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Nb44/Nb42酶联免疫吸附试验缓冲液的优化，抵消血浆基质效应。
基质：样品中目标分析物以外的部分。由于基质成分会对分析过程有显著干扰，影响分析结果的准确性。
业内把这些影响统称为基质效应。这是ELISA试剂盒开发和使用中需要避开的雷。

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抵消基质效应的ELISA实验，寻找最佳缓冲液
小鼠血浆中加入重组TcoPYK(3μg/ml)，或直接使用，或者用PBS缓冲液3倍稀释。PBS缓冲液种加入不同含量的盐(100 mM和300 mM NaCl)或非离子洗涤剂(0.5%和1.0% Tween-20)。
捕获抗体Nb44H每孔包被浓度为5μg/ml
检测抗体Nb42HA作为主要检测试剂(浓度为1μg/ml)。
最好的缓冲液条件是3倍稀释PBS，含有1%吐温-20。
(A: PBS, B: PBS+100mM NaCl, C: PBS+300mM NaCl, D: PBS+0.5% Tween20, E: PBS+1.0% Tween20).

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提高最小检测量的TcoPYK夹心ELISA实验
采用了三种方案进行改进，包括将捕获抗体NB44改造成双价Nb44-Nb44，检测抗体进行HRP标记等。
也是用棋盘滴定法寻找抗体的最佳工作浓度。
其中双价Nb44-Nb44起始浓度为6ug/ml，生物素化的Nb42抗体起始浓度为0.25ug/ml。
检测抗原为加有重组TcoPYK蛋白 (1μg/ml) 的小鼠血浆。2倍倍数稀释。
为减少基质效应，每个检测抗原又用PBST进行3倍稀释。
两个ELISA板进行平行操作
第一个板子用Nb44H作为捕获抗体 (5 μg/ml) ，HRP-抗体作为二抗(0.5μg/ml,用封闭液进行稀释)。
第二个板子用Nb44-Nb44作为捕获抗体(5μg/ml)，HRP-抗体作为二抗(1μg/ml，用封闭液进行稀释)
两个板子的一抗均是NB42B (浓度调整到1ug/ml).

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提高Nb42/Nb44 ELISA的检测灵敏度：
通过减少检测步骤对Nb44/Nb42 ELISA检测进行优化
① 生物素标记检测抗体Nb42 (Nb42B)，这样可以直接作用于链霉素-酶底物（strep-HRP)，替代加Nb42HA后还需再加入HRP-抗HA，再加底物的检测步骤。最低检测浓度为16ng/ml。
② 用链霉素-多价酶底物（strep-polyHRP)代替链霉素-酶底物（strep-HRP) ，将最低检测浓度降低到2ng/ml。

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③ Nb44的量和检测的灵敏度关系很大，SPR检测Nb44对TcoPYK的亲和度较Nb42要低。
推测使用二价Nb44 (Nb44-Nb44)作为捕获抗体会增加检测的灵敏度。
对Nb44/Nb42和Nb44-Nb44/Nb42进行比较，发现使用Nb44-Nb44作为捕获抗体可显著提高LoD至~0.5ng/ml。

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最终定下的ELISA装置为双价Nb44-Nb44H作为捕获抗体。单价Nb42B作为检测抗体。
strep-polyHRP用于底物显色
This Nb44-Nb44/Nb42 ELISA was evaluated as such in mouse infection trials (see below).

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TcoPYK胶体金制作：

LFA金垫是由聚酯组成（VL98)。硝基纤维素膜毛细管流速为135s/4cm，样品垫为玻璃纤维材质。
66μM的Nb44或Nb44-Nb44吸附在100ml胶体金颗粒上，作用30min。
对照抗体用100ml的胶体金颗粒加1mg的兔多抗IgG。
用1% BSA封闭胶体金颗粒，作用20min。
离心浓缩20倍，喷于预处理过的金垫上，37°C过夜干燥。
同时，采用2:1摩尔比，将Nb42B：链霉亲和素检测线加到硝化纤维素膜上。质控线用山羊抗兔子的IgG（1mg/ml，溶于3%海藻糖里）
试纸条宽0.4cm，制备好后装入卡盒里。

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Nb44/Nb42抗体对制备胶体金：Nb42和Nb44识别TcoPYK不同的抗原表位，可以用于制备胶体金试纸条。
两个抗体可以互换配对，一个作为捕获抗体，一个作为检测抗体。
在夹心ELISA中，捕获抗体先接触抗原。
While in a sandwich ELISA the capturing agent interacts with the target antigen prior to the detecting agent, this is no longer true in an LFA (i.e. the detecting agent interacts with the target antigen before the capturing agent). Tus, in the LFA format, Nb44 and Nb42 act as detecting and capturing agents, respectively, instead of vice versa as for the sandwich ELISA (Fig. 5a). 检测线包括山羊抗小鼠goat monoclonal anti-rabbit IgG which recognises rabbit polyclonal IgG AuNPs that are also applied to the conjugate pad with the Nb44-AuNPs since a monoclonal anti-Nb is currently not available.