Flavivirus reverse genetic systems, construction techniques and

傲慢与偏见

选择不同的DNA依赖的RNA聚合酶启动子：从cDNA在体外，或者体内有效得到病毒RNA，病毒基因组两侧需要加入合适的启动子。
黄热病毒感染性克隆最常用的启动子是噬菌体T7，SP6，CMV启动子
噬菌体启动子用于体外反转录产生大量病毒RNA，通常SP6聚合酶/启动子的效率低于T7。
RNA聚合酶存在一定的致错率，因此不适合作为一致性好的基因模板进行转染。

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CMV启动子
插入真核启动子的cDNA感染性克隆，能在真核细胞中，进行细胞内转录，获得全长RNA。
其他的正链RNA，包括脊灰，手足口病毒颗粒，甲型病毒，冠状病毒，植物病毒等，采用这种方式构建感染性克隆。
有两株WNV的感染性克隆也采用这种结构。
和T7，SP6比较，这种启动子在细菌中依然具有比较活跃的转录活性，因此在细菌中不够稳定，具有毒性。

傲慢与偏见

3.1.2.1.4. 采用不同的策略采取不同的策略减缓在构建克隆过程中发生缺失，插入或者移码的问题。
减少细菌内的毒性：为了解决基因组中潜在启动子。充分利用原核和真核系统中，mRNA的形成机制不同。
在克隆构建中发现单个无义突变，提早形成了一个终止密码子，通过阻止毒性蛋白的产生，对克隆起稳定作用。
在克隆中插入含有终止密码子的内含子序列，打断ORF框。在原核细菌中，可在翻译水平可以阻断毒性蛋白的生成。
在真核细胞中，能在核内进行转录，伴随着剪切，精准切掉内含子序列，得到原始的正确ORF。
对于病毒感染性克隆，病毒复制依赖的表达载体，mRNA输入到胞浆中，翻译得到病毒蛋白，启动病毒进入感染周期，或者载体RNA的复制。

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在病毒基因组ORF中插入内含子或者通过移码突变，能够增加受真核启动子操控的质粒在细菌中的稳定性。说明在细菌中来自真核启动子的假转录对于质粒的不稳定性起重要作用。
为了减少或者消除在感染性DNA克隆中真核启动子假转录带来的不稳定因素。
他们对真核启动子进行操作，减弱启动子的功能，降低了假转录带来的毒性作用。但是这个方法不能解决病毒基因组中出现原核启动子结构造成的不稳定问题。

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Pu et al. 等还研发了一个方法用于构建稳定的全长cDNA克隆。通过降低病毒基因组序列在大肠杆菌中的内在毒性，来构建稳定的全长黄病毒cDNA。
他们证明了DENV-2和JEV cDNA克隆的不稳定性原因。
在于多个可能的类似大肠杆菌启动子(ECP)序列造成病毒蛋白的隐式表达导致对细菌产生毒性。
因此，他们设计了一种新的制备传染性DENV-2和JEV cDNA克隆的方法，在ECP序列中引入沉默突变，减弱ECP活性，增加了cDNA克隆的稳定性，从而构建了DENV-2和JEV cDNA的感染性克隆。

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Pu等将7个串联的四环素反应序列(7XTRE)，插入到小CMV启动子序列前方，构建了稳定的DEN-2和JEV感染性克隆。

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Yeast: Some full-length flaviviral cDNA genomes, unstable in E.
coli, were successfully cloned in eukaryotic systems which are
often more tolerant than bacteria to toxic flavivirus sequences presumably because they promote less cryptic viral protein expression. The yeast Saccharomyces cerevisiae is a popular eukaryotic
host in cases for which viral cDNA was assembled by homologous
recombination. The two common strategies for cloning DNA in
yeast are the assembly of yeast artificial chromosomes (YACs)
and the use of yeast-E. coli shuttle vectors such as pRS424. Using
this approach, Polo et al. (1997) assembled full-length DENV-2
cDNA in yeast by recombination in vivo, followed by transformation of E. coli to produce plasmid DNA for in vitro transcription
(Polo et al., 1997). Similar approach have also been applied for
DENV-3 (Santos et al., 2013). Even if the problems with deleterious
effects and instability in the E. coli host were not completely eliminated, this method enabled recovery of infectious full-length RNA
transcripts. Of the two methods used to assemble the full-length
DENV clone, the shuttle vector approach was simpler and more
reliable than the YAC approach essentially due to the need of a supplementary cloning step before the infectious clone could be recovered from the YAC in bacteria. The same method has also been used
to assemble full-length DENV-1 (Puri et al., 2000) and DENV-4
(Kelly et al., 2010) cDNAs.

傲慢与偏见

病毒RNA基因组有感染性，1ng的量转染细胞即能重新生成病毒。体外转录而得的RNA因为本身质量以及容易降解的缘故，需要100ng转染细胞以拯救病毒。
采用DNA/RNA技术，引入真核启动子，转染细胞中，通过核转录原位生成病毒RNA，从而启动病毒RNA的复制。
该方法在很多植物病毒中得以应用。动物病毒则应用不是很广泛，因为如果在大肠杆菌中病毒基因组片段的额外表达是导致质粒不稳定的主要因素，真核启动子的加入只会加剧其有害影响。

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在24个乙脑流行国家中，每年约发生67 900例乙脑病例(总发病率:每10万人1.8例)，其中只有约10%报告给世界卫生组织。其中约33 900例(50%)发生在中国(不包括台湾)，约51 000例(75%)发生在0-14岁儿童中(发病率:每10万人中5.4例)。大约55 000例(81%)病例发生在已建立或正在开展乙脑疫苗接种规划的地区，而大约12900例(19%)发生在很少或没有乙脑疫苗接种规划的地区。

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嵌合病毒技术
以减毒病毒或者疫苗株为骨架，起到免疫原的作用。
结构基因E-prM蛋白提供抗原决定簇，诱导保护性中和抗体。
首个嵌合病毒是DENV型间的嵌合病毒。
是将DENV-4  814669毒株的C-prM-E基因或者prM-E基因-NS1基因用DENV-1, DENV-2 或者 DENV-3 毒株的同位置基因替代，嵌合病毒能在细胞中生长，展示了期望的抗原特异性，在猴体内产生中和抗体。