single domain antibodies：methods and protocols

傲慢与偏见

抗独特型抗体(anti-idiotypic antibody)是能够识别另一抗体可变区，并产生特异性结合的抗体。

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细菌细胞质是一个还原环境，破坏了纳米抗体内部二硫键的形成。然而，一些VHHs可以不依赖二硫键的存在，独立折叠成有功能的结构。
另外，不依赖二硫键的纳米体(如胞内抗体)，融合到瓜霉素等蛋白上，也能在胞内产生融合抗体。
此外，早期结果显示有抗芽孢炭疽杆菌的纳米抗体很稳定，并且有胞内抗体的功能，因此，Anderson等将纳米抗体和β半乳糖苷酶进行融合，直接在Tuner (DE3)大肠杆菌细胞质内进行表达。

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由抗体Fab和Fc结构域介导并受铰链区调控的不同亲和力相互作用引起的亲合力，可根据达到的多价性水平分为不同层级：
一级亲合力，是指二价Fab与抗原的相互作用；
二级亲合力，是指Fab–抗原和Fc–Fc或Fab–Fab同时相互作用；
三级亲合力，是指免疫复合物和免疫效应分子之间的相互作用。

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体液免疫反应的效率取决于它产生的无限多种的抗体分子。机体所有细胞的胚系基因组中都有Ig基因，但是只有骨髓干细胞向B淋巴细胞分化成熟时，才发生免疫球蛋白基因的重排，将位于不同染色体上，由非编码序列隔开的重链如V,D,J基因，轻链如V,J基因进行重新组合。人的Ig重链基因群位于第14号染色体长臂，由编码可变区的V基因片段，D基因，J基因片段以及编码恒定区的C基因片段组成。
轻链基因群分为K基因和λ基因，分别定位于第2号染色体短臂和第22号染色体长臂，轻链可变区只有V基因和J基因片段，以及恒定区C基因。
在B细胞发育过程中，重链可变区首先重排，然后是轻链可变区，轻链可变区基因发生基因重排时，先启动的是K链，当K链重排失败后，λ链会启动重组机制，保证一个B细胞只含有一个有功能的重链可变区DNA和一个轻链可变区序列，也就是只能产生一种特异性抗体。

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重链/轻链基因可以发生重排，是因为这些基因片段相对的一侧有重组信号序列，即RSS。每个RSS包括一个七核苷酸的七聚体，序列为CACAGTG，和一个富含AT的九核苷酸的九聚体，序列为ACAAAAACC。
七聚体和九聚体之间是一段非保守序列，即12bp或23bp两种间隔序列。
根据间隔序列的不同，RSS也分为两种，one-turn RSS（12bp)，two-turn RSS（23bp)。
在一系列酶的催化下，one-turn RSS和two-turn RSS完成Ig基因的重排。
抗原刺激B细胞后，发生抗体轻重链基因重排，重链可变区形成V-D-J连接，轻链可变区形成V-J连接后，再与相应的C基因片段连接，编码完整的Ig多肽链，一个B细胞能产生一种独特的抗体，不同的B细胞则产生数量巨大，能识别不同特异性抗原的抗体。

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抗体的多样性除了因为可变区基因不同片段组合本身引起的多样性，另外因为重组本身不是很精准，在片段连接位点存在一定的变异范围，有缺失或者插入核苷酸的情况发生，从而带来编码产物的多样性。

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此外，体细胞高频突变也是引起抗原结合位点多样性的原因，这些突变不是在胚系基因中发生，而是在已重排的可变区基因中发生。在抗原刺激后，在热点位置高频发生突变，比自发突变频率高10万倍，基本上是细胞每分裂一两次，引入一个突变，突变后的抗体有些亲合力会高于原先的抗体分子，称之为抗体亲和力成熟。

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在哺乳动物中，抗体的组成和结构非常保守。

近年来报道的，有三种和传统抗体四聚体不同的重链抗体，不含有轻链：

① 重链抗体病，患者血清中存在大量无功能活性的重链抗体，抗体缺失VH和CH1区域。

② 在驼类的血清中发现天然缺失轻链的重链抗体，在体液免疫中起到重要作用。

③

The genetic evidence indicates that
the origin of HCAbs is not to be found in remnants of a putative
primordial HCAb form but that they are apparently the outcome
of more recent adaptive changes occurring in the compartment of
the conventional antibodies within the Camelidae lineage (11).
The third type of heavy chain-only antibodies is occurring naturally in shark (12) (see Chapter 3)

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重链抗体的CDR1区和FR2区存在半胱氨酸残基，可以和CDR3区中的半胱氨酸形成二硫键，增加了可变区的稳定性和结构变化。

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驼类的重链抗体：
驼类体内存在三种不同的抗体分子，根据其结合蛋白G/A能力的不同以及分子大小的不同，分为传统IgG1分子，包含两个重链，两个轻链。IgG2/IgG3抗体则只有重链，并且重链分子量和传统抗体比较，因为少了一段CH1区，分别小10/12kDa。
重链抗体胚系基因序列中原本存在CH1区序列，但是经过重组后的成熟重链抗体可变区mRNA中不存在，因此推测在基因重排的过程中发生CH1的剪切。可变区直接和铰链区连接在一起。
重链CH1区和抗体从内质网分泌有关，CH1和特异性伴侣分子结合，保留在内质网上，当伴侣分子被轻链分子替代后，促进抗体从内质网分泌。重链抗体CH1区缺失，因此在体内分泌的速度更快。